Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
Sắc ký cột phân đoạn EtOAc
+ Chuẩn bị mẫu: 25,2 g cặn chiết phân đoạn EtOAc cho vào bình cầu thêm lƣợng tối thiểu EtOAc, thêm khoảng 25 g silica gel, lắc đều. Cất quay dƣới áp suất giảm loại hết EtOAc thu đƣợc hỗn hợp rắn. Nghiền hỗn hợp rắn thu đƣợc bằng cối sứ thành hỗn hợp tơi xốp, đồng đều. Cảm quan hỗn hợp khô tơi, màu đồng nhất.
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Chọn cột sắc ký có đƣờng kính = 5 cm, chiều cao h = 30 cm. Cân khoảng 250 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm ngập DCM, khuấy đều cho hết bọt khí. Để yên 12 h. Lót ở đáy cột một lớp bông mỏng rồi rót từ từ hỗn dịch DCM lên cột. Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời bổ sung dung môi, để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, để mức DCM khoảng 3-5 mm, đƣa hỗn hợp chất đã trộn silica gel lên cột. Sau đó phủ lên phía trên bằng một lớp bông mỏng để tránh xáo trộn bề mặt.
+ Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM-MeOH-H2O với tỉ lệ nhƣ trong bảng 3.2, hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm thể tích 50 ml, kiểm tra bằng SKLM.
Bảng 3.2. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn EtOAc Hệ dung môi DCM (ml) MeOH (ml) H2O (ml)
Hệ I 100 0 0 Hệ II 300 20 2 Hệ III 800 80 8 Hệ IV 1000 200 20 Hệ VI 300 100 10 Hệ VII 200 200 20 Hệ VIII 0 100 0
Khảo sát bằng SKLM, gộp các phân đoạn thích hợp và cất thu hồi dung môi thu đƣợc 17 phân đoạn trong đó có 3 phân đoạn chính ký hiệu PE1, PE2, PE3.
Tiếp tục tiến hành tách phân đoạn PE1 (1,4 g) bằng sắc ký cột pha thƣờng, rửa giải bằng hệ dung môi DCM – MeOH – H2O (10:1:0,1-1:1:0,1) và theo dõi bằng SKLM, gộp các ống chứa chất sạch với nhau và cô loại bỏ dung môi, đến khi xuất hiện chất kết tinh, tiến hành lọc và rửa tủa bằng aceton ta thu đƣợc hợp chất 1
(PE30) (15 mg) và hợp chất 2 (PE33) (7 mg).
Phân đoạn PE2 (2,3 g) đƣợc tách trên cột silica gel thành 3 phân đoạn (PE21 - PE23), hệ dung môi rửa giải là DCM – MeOH – H2O (10:1:0,1-1:5:0,1). Hợp chất
3 (PE31) (11 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo phân đoạn PE21, rửa giải bằng Aceton – H2O (2:1).
Nhƣ vậy, bằng phƣơng pháp sắc ký cột pha thƣờng silica gel và pha đảo RP- 18 đã phân lập đƣợc 3 hợp chất, các hợp chất phân lập đƣợc loại hết dung môi, gửi đi đo phổ, ký hiệu 1 (PE30), 2 (PE33), 3 (PE31). Dƣới đây là hình ảnh sắc ký đồ bằng TLC của cao PE và các hợp chất phân lập đƣợc (hình 3.4).
PE (25,2 g)
PE1(1,4 g) PE2 (2,3 g)
CC: Silica gel, DCM-MeOH-H2O (100% DCM-5:1:0,1-100% MeOH) CC: Silica gel, DCM – MeOH – H2O (10:1:0,1-1:1:0,1) 1 (15 mg) 2 (7 mg) PE3 (1,3 g)
CC: Silica gel, DCM – MeOH – H2O (10:1:0,1-1:5:0,1)
PE21 PE22 PE23
CC: RP-18, Aceton – H2O (2:1)
3 (11 mg)
Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) cao phân đoạn EtOAc và các hợp chất phân lập đƣợc
Hệ dung môi: DCM – MeOH – H2O (8:1:0,1) Trong đó:
1. Hợp chất 1 (PE30), 2. Hợp chất 2 (PE33), 3. Cao PE, 4. Hợp chất 3 (PE31)
A. Sắc ký đồ tại bƣớc sóng 254 nm
B. Sắc ký đồ tại bƣớc sóng 366 nm
C. Sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng, tại bƣớc sóng 366 nm