- Phƣơng pháp chiết xuất [8,9]
Phƣơng pháp chiết nóng: sử dụng cồn 70o
ở 70o C
Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng: sử dụng để chiết thành các cao phân đoạn
- Phƣơng pháp phân lập và tinh chế chất tinh khiết:
Phƣơng pháp SKLM, SKC (nguyên tắc theo hình 2.2) [9,12]. Phƣơng pháp rửa, kết tinh
- Phƣơng pháp phổ và so sánh các cơ sở dữ liệu để xác định và nhận dạng cấu trúc: Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các thông số vật lý và các phƣơng pháp phổ bao gồm: điểm chảy, độ quay cực, phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (phổ 1 chiều: 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT), phổ 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC) … [9] và so sánh với các cơ sở dữ liệu thực nghiệm và cơ sở sở dữ liệu trƣớc đó.
Hình 2.2. Nguyên tắc sắc ký [12]
Minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm chất A, B và C (lực tƣơng tác với pha tĩnh của A < B < C) theo thời gian.
CHƢƠNG 3 – THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Định tính các nhóm chất
3.1.1. Đinh tính tanin
Tiến hành: Cho khoảng 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nƣớc cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc cho đều vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 2 ml để làm định tính.
Ống nghiệm 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều.
Hiện tượng: Sau phản ứng dung dịch có vẩn đục màu vàng nâu. Vẩn đục vàng nâu xuất hiện là do tanin tạo kết tủa với muối kim loại sắt.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%, lắc đều.
Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch có xuất hiện kết tủa rất rõ rệt. Do tanin tạo kết tủa với muốikim loại chì.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Ống nghiệm 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%, lắc đều.
Hiện tượng: Sau phản ứng thì dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Kết luận chung: 2/3 phản ứng dƣơng tính với tanin
3.1.2. Định tính flavonoid
Tiến hành: Cho 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25 ml cồn 90o, đun cách thủy sôi trong 10 phút, lọc nóng đƣợc dịch chiết cồn, đem làm các phản ứng flavonoid.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater): Dung dịch trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tƣơi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanon, flavanonol.
Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng và xuất hiện bọt khí thoát ra mạnh mẽ.
Mg + HCl → MgCl2 + H2
Phản ứng với FeCl3 5%: Tùy theo nhóm Flavonoid và tùy theo số lƣợng, vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu.
Hiện tượng: Dung dịch có xuất hiện kết tủa và chuyển sang màu nâu sẫm.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với hơi NH3:
Hiện tượng: Trên giấy lọc có xuất hiện màu vàng rất nhạt là do nồng độ Flavonoid rất ít và tùy theo nhóm Flavonoid.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng diazo hóa
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút)
Hiện tượng: Dung dịch xuất hiện màu vàng đậm dần lên là do thuốc thử diazo có màu vàng cam.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Kết luận chung: Nhƣ vậy 2/4 phản ứng dƣơng tính.
3.1.3. Định tính saponin
Tiến hành định tính : Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dƣợc liệu, thêm 5 ml nƣớc. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tƣợng tạo bọt.
Hiện tượng: Quá trình tạo bọt xảy ra rất mãnh liệt và bọt còn bền vững sau 15 phút.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính mạnh.
3.1.4. Định tính alcaloid
Tiến hành định tính: Cho khoảng 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung dịch amoniac đặc. Sau 30 phút thêm 25 ml cloroform vào, đậy kín. Sau 12 giờ lọc lấy dịch chiết cloroform cho vào bình gạn. Lắc kỹ với 10 ml dung dịch H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết acid lại với nhau, đem làm phản ứng (khi đó dịch có màu trắng).
Phản ứng với thuốc thử Mayer (K2HgI4)
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer (Các alcaloid sẽ cho tủa vô định hình màu trắng hoặc trắng ngà).
Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI4)
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff (Các alcaloid cho tủa màu đỏ cam đến đỏ).
Hiện tượng: Dung dịch chuyển từ không màu sang màu cam do thuốc thử Dragendorff có màu cam.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat (Các alcaloid cho tủa màu nâu đến nâu đen).
Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Kết luận chung: Nhƣ vậy không có phản ứng nào dƣơng tính với Alcaloid.
3.1.5. Định tính glycosid
Tiến hành định tính: Cho 10 g bột dƣợc liệu vào bình nón 250 ml, ngâm trong 50 ml cồn 25o trong 24 giờ. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ 100 ml, đem loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến dƣ. Lọc bỏ tủa qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 100 ml, nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat là lúc đó lƣợng chì acetat đã đủ. Cho dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml lắc với chloroform, mỗi lần 8 ml. Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã sấy khô, chia đều vào 6 ống nghiệm nhỏ đem cô cách thủy. Cắn thu đƣợc để làm các phản ứng.
Phản ứng Liebermann – Burchard
Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn, nghiêng ống 45o
, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tượng: Dung dịch phân ra thành 2 lớp, lớp dƣới có màu trắng còn lớp trên có màu nâu nhạt.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu vàng.
Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ trắng sang vàng, do dịch chiết đƣợc hòa tan với ethanol và phản ứng với thuốc thử Natri nitroprussiat.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (có màu cam) mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam.
Hiện tượng: Ta so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid, thấy ống thử có màu cam đỏ đậm hơn ống chứng.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong lòng ống.
Hiện tượng: Dung dịch trong ống nghiệm phân thành hai lớp, lớp dƣới có màu trắng đục lớp trên có màu nâu.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Kết luận chung: Nhƣ vậy 4/4 phản ứng dƣơng tính với Glycosid.
3.1.6. Định tính coumarin
Tiến hành định tính: Lấy 10 g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90o, đun cách thủy tới sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu đƣợc đem làm các phản ứng sau.
Phản ứng mở, đóng vòng lacton
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết: Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để nguyên
- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát: Ống 1: Có tủa đục màu vàng
Ống 2: Vàng trong
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nƣớc cất, lắc đều rồi quan sát: Ống 1: Dung dịch có màu vàng trong.
Ống 2: Vẫn giữ nguyên hiện tƣợng.
Kết luận: Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo.
Hiện tượng: Khi nhỏ thuốc thử Diazo vào dung dịch sẽ có màu vàng.
Kết luận:Phản ứng dƣơng tính.
Kết luận chung: Dƣợc liệu có coumarin.
3.1.7. Định tính chất béo, caroten, sterol
Tiến hành định tính: Ngâm 5 g dƣợc liệu trong bình nón dung tích 50 ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm (15 giờ). Lọc lấy dịch lọc đem làm các phản ứng sau:
Định tính chất béo: nhỏ một vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên một miếng giấy lọc để khô rồi quan sát.
Hiện tượng: Sau khi sấy khô thì vẫn còn thấy vết dung môi.
Kết luận: Trong dƣợc liệu có chứa chất béo.
Định tính caroten: lấy 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa cho vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy đến cắn. Cho thêm 2 giọt acid H2SO4 đặc vào. Khi đó, dung dịch có màu xanh lam.
Hiện tượng: Dung dịch có màu xanh lam do cắn phản ứng với H2SO4 đặc.
Kết luận: Trong dƣợc liệu có chứa caroten.
Định tính Sterol: Lấy 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi cách thủy tới cắn, cho thêm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Đặt nghiêng ống nghiệm 45o, rồi thêm từ từ 0,5 ml dung dịch acid H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Hiện tượng: Dung dịch phân thành hai lớp trắng và xanh. Do anhydrid acetic hòa tan với cắn sau đó phản ứng với H2SO4..
Kết luận: Trong dƣợc liệu có chứa Sterol.
3.1.8. Định tính đƣờng khử, acid amin, acid hữu cơ
Tiến hành định tính: Cho 5 g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm to (15 ml), thêm 10 ml nƣớc, đun cách thủy trong 10 phút. Lọc lấy dịch lọc đem định tính.
Định tính đƣờng khử: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và ba giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy trong 5 phút.
Hiện tượng: Dung dịch có xuất hiện kết tủa có màu đỏ gạch.
Kết luận: trong dƣợc liệu có chứa đƣờng khử.
Định tính acid hữu cơ: Cho 2 ml dịch chiết ở trên vào ống nghiệm rồi thêm một ít tinh thể Na2CO3.
Hiện tượng: Không thấy dung dịch có hiện tƣợng gì xảy ra.
Kết luận: Trong dƣợc liệu không có chứa acid hữu cơ.
Định tính acid amin: Cho 2 ml dịch chiết ở trên vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy trong 10 phút.
Hiện tượng: Không thấy dung dịch có hiện tƣợng gì xảy ra.
Kết luận: Trong dƣợc liệu không có chứa acid amin.
3.1.9. Định tính polysaccharid
Tiến hành định tính: Cho 2 g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm to (15 ml), thêm 10 ml nƣớc cất, đun cách thủy sôi trong 5 phút, lọc nóng. Sau đó cho vào 2 ống nghiệm:
Hiện tượng: Dung dịch chuyển sang màu vàng do thuốc thử Lugol đã có màu vàng.
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Ống nghiệm 2: 4 ml nƣớc cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.
Hiện tượng: Dung dịch không thấy hiện tƣợng gì xảy ra
Kết luận: Phản ứng âm tính.
Kết luận chung: Dƣợc liệu không chứa polysaccharid.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ quả PPC
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận 1 Tanin Phản ứng với FeCl3 + Có Phản ứng với chì acetat 10% + Phản ứng với gelatin 1% - 2 Flavonoid Phản ứng cyanidin - Có Phản ứng với FeCl3 + Phản ứng với hơi NH3 + Phản ứng diazo hóa + 3 Saponin Phản ứng tạo bọt +++ Có 4 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không Phản ứng với TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat - 5 Glycosid Phản ứng Libermann - Bouchardat + Có Phản ứng Legal + Phản ứng Baliet +
Phản ứng Keller - Kiliani +
5 Coumarin
Phản ứng đóng mở vòng lacton +
Có Phản ứng diazo hóa +
6 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc + Có 7 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc + Có 8 Sterol Phản ứng Liberman + Có 9 Đƣờng khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có 10 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không 11 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin 3% - Không 12 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol - Không
Trong đó: “+”: phản ứng dƣơng tính, “++”: phản ứng dƣơng tính rõ, “+++”: dƣơng tính rất rõ, “-” : phản ứng âm tính
Nhƣ vậy, bằng các phản ứng định tính cho thấy vỏ quả cây Bảy lá một hoa có những nhóm hợp chất: tanin, flavonoid, saponin, glycosid, coumarin, chất béo, caroten, sterol, đƣờng khử (bảng 3.1).
3.2. Chiết xuất
Vỏ quả khô (quả đã bỏ loại hạt) (0,5 kg) đƣợc nghiền nhỏ và chiết nóng 3 lần, mỗi lần với dung môi ethanol – nƣớc (7 : 3), tỷ lệ dƣợc liệu – dung môi là 1:10, ở nhiệt độ 70°C. Gộp và cô loại bỏ dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 124,5 g cao ethanol 70%(PCEt). Cao ethanol 70% này đƣợc phân tán vào lƣợng nƣớc tối thiểu (khoảng 600 ml nƣớc) và chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với các dung môi n-hexan và ethyl acetat (tỷ lệ dịch cao phân đoạn – dung môi (1:1)), mỗi dung môi chiết 3 lần), cô loại bỏ dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc các cao chiết phân đoạn: n- hexan (1,5 g) và ethyl acetat (PE, 27,6 g), phân đoạn nƣớc (64,5 g) (hình 3.1).
Sau khi chiết các cao phân đoạn, qua tổng quan tài liệu tôi thấy đa số hợp chất đã phân lập đƣợc từ phân đoạn cặn chiết EtOAc của Bảy lá một hoa. Nên chúng tôi lựa chọn phân đoạn ethyl acetat để tiền hành phân lập chất.
3.3. Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao ethyl acetat 3.3.1. Khảo sát bằng SKLM 3.3.1. Khảo sát bằng SKLM
Mục đích: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để phân lập chất
Tiến hành: Sử dụng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng pha thƣờng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck) đã hoạt hóa, sử dụng các hệ dung môi khác nhau để khảo sát sự phân tách các chất.
Kết quả: hệ 3 dung môi: diclomethan – methanol – nƣớc (8:1:0,1) cho sự phân tách tốt nhất, sắc ký đồ phát hiện bằng cho nhiều vết nhất, các vết tách xa nhau với giá trị hằng số lƣu (Rf) khác nhau (hình 3.2).
Hình 3.2. Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của cao ethyl acetat.
Hệ dung môi: diclomethan – methanol – nƣớc (8:1:0,1)
1. Không phun TT H2SO4 10% trong ethanol, UV254
2. Phun TT H2SO4 10% trong ethanol, to
Bột phần vỏ quả PPC (0,5 kg)
- Chiết nóng ở 70oC với ethanol 70% ( 3 lần, 3h/lần), tỷ lệ dƣợc liệu/dung môi (1:10)
- Cất loại dung môi dƣới áp suất giảm Cao ethanol 70%
(PCEt, 124,5 g)
- Phân bố cao trong 600 ml nƣớc
- Chiết lỏng-lỏng lần lƣợt bằng các dung môi: n-hexan, ethyl acetat
- Cất loại dung môi dƣới áp suất giảm
Cao phân đoạn
n-hexan (1,5 g)
Cao phân đoạn ethyl acetat (PE, 27,6 g)
Cao phân đoạn nƣớc (64,5 g)
3.3.2. Phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký cột
Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
Sắc ký cột phân đoạn EtOAc
+ Chuẩn bị mẫu: 25,2 g cặn chiết phân đoạn EtOAc cho vào bình cầu thêm lƣợng tối thiểu EtOAc, thêm khoảng 25 g silica gel, lắc đều. Cất quay dƣới áp suất giảm loại hết EtOAc thu đƣợc hỗn hợp rắn. Nghiền hỗn hợp rắn thu đƣợc bằng cối sứ thành hỗn hợp tơi xốp, đồng đều. Cảm quan hỗn hợp khô tơi, màu đồng nhất.
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Chọn cột sắc ký có đƣờng kính = 5 cm, chiều cao h = 30 cm. Cân khoảng 250 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm