1.2.1. Giới thiệu chung
Saponin hay saponoid là một nhóm glycosid lớn, Sapo trong tiếng la tinh có nghĩa là xà phòng. Saponin có mặt trong các lòa thực vật nhƣ một số cây họ đậu: đậu tƣơng, đậu Hà Lan và một số loài động vật nhƣ: hải sâm, cá sao…Cấu trúc saponin gồm 2 phần: Aglycone và Glycone.
Hình 1.2. Cấu trúc của saponin
Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin
steroid.
1.2.2. Các nhóm saponin
Các hợp chất saponin đƣợc phân loại thành 2 nhóm khác nhau dựa vào khung cấu trúc hóa học của các hợp chất:
SAPONIN Glycone Aglycone Sugar Sapogen 4. Glucuronic 3. Xylose 2.Arabinos e 1. Glucose Steroids Triterpenoi d Neutral Acid
1.2.2.1. Saponin triterpenoid
Saponin triterpenoid có bản chất là các hợp chất triterpenoid gốm 6
nhóm hemitrerpen, tạo nên 2 loại: - Saponin triterrpenoid pentacyclic: Bao
gồm các nhóm nhỏ: Olean, Ursan, Lupan, Hopan.
+ Nhóm Olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này. 1 2 3 4 5 6 7 8 27 23 24 15 16 17 28 30 20 21 22 29 19 18 12 11 25 R2 R5 R3 R4 R1 OH (A) olean β-amyrin R1=R2=R3=R4=R5= CH3
Hình 1.3. Khung cấu trúc nhóm olean và β-amyrin
Cấu trúc hóa học: Phần aglycon thƣờng có 5 vòng và thƣờng là dẫn chất của 3-hydroxy olean 12-ene, tức là -amyrin.
+ Nhóm Ursan: Nhóm ursan có cấu trúc tƣơng tự olean chỉ khác nhau ở nhóm methyl ở C-30 không đỉnh vào vị trí C-20 mà đỉnh vào C-19.
CH3
H
Ursan α-amyrin
19
Các sapogenin nhóm ursan thƣờng là những dẫn chất của 3-hydroxy ursan 12-ene, tức là -amyrin.
+ Nhóm Lupan: A E C D B Lupan Hình 1.5. Khung cấu trúc nhóm lupna
Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống các nhóm trên chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thƣờng có nối đôi ở vị trí
C20-C29.
+ Nhóm Hopan: cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống nhƣ các nhóm trên, vòng E là vòng 5 cạnh giống nhóm lupan. Tuy nhiên,
nhóm C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl gốc đỉnh C-18 thay vì ở C-17.
Hopan
- Saponin triterpenoid: Nhóm này đƣợc chia làm 3 nhóm nhỏ:
Dammaran, Lanostan, Cucurbitan.
+ NHóm Dammaran: Phần Aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh, Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran.
Bằng các phƣơng pháp đặc biệt để cắt phần đƣờng, ngƣời ta đã thu đƣợc các genin thật. Hai genin chính là protopanaxadiol và protopanaxatripol. Phần đƣờng nối vào OH ở C-3 hoặc có khi thêm một mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. OH OH OH OH OH OH OH Protopanaxadiol Protopanaxatriol
Hình 1.7. Hai genin Protopanaxadiol, Protopanaxatriol khung Dammaran.
+ Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này.
O O O O O O O O O O O H H OH OH H HO OH H HO OH H OH O H OH OH O H OH OH S O O O Na
21
+ Nhóm Cucurbitan: Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3gốc thay vì ở vị trí C-10 lại đính ở C-9.
O OH OH OH OH O OH OH OH OH
Hình 1.9. Momorcharaside B khung Cucurbitan 1.2.2.2. Saponin steroid
- Nhóm spirostan: Ta xét 3 chất sapogenin làm ví dụ: sarsasapogenin,
smilagenin, tigogenin. Những chất này có 27 carbon nhƣ cholesterol, nhƣng mạch nhánh từ C20-27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy), một vòng là hydrofuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F). Hai vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C-22. Mạch nhánh này đƣợc gọi là mạch nhánh spiroacetal. O O OH H H A C D E 27 25 26 24 23 22 20 21 17 18 13 14 8 9 12 11 19 4 6 7 10 5 1 2 3 15 16 B F O O OH H H Sarsasapogenin Smilagenin
O O OH H H Tigogenin Hình 1.10. Ba chất sapogenin
Các sapogenin nhóm này có nối vòng C Và D trans. Còn vòng A và B có thể là cis nhƣ ở chất sarsasapogeninvà smilagenin hoặc có thể là trans nhƣ ở chất tigogenin.
- Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tƣơng tự nhƣ nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi.
Trƣờng hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm ancol bậc 1 ở C-26 đƣợc nối với đƣờng glucose. Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzim hoặc acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. Ví dụ sarsaparillosid dƣới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin.
O O H H duong OH H CH3 CH2-O-gle O O CH3 H O duong H Sarsaparillosid Parillin Hình 1.11. Thủy phân Sarsaparillosid Trƣờng hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25
epoxy, ví dụ avenacosid có trong yến mạch (Avena L. Họ lúa - Poaceae). enzym
23
Avenacosid A cũng có 2 mạch đƣờng. Khi thủy phân cắt đƣờng glucose ở C-
26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan. O O CH3 O duong CH2 -O-gle O O OH HO CH3 Avenacosid Ionuatigenin Hình 1.12. Thủy phân Avenacosid A
- Nhóm aminifurostan: Ở đây vòng F mở nhƣ trƣờng hợp sarsaparillosid nói ở trên nhƣng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2.
- Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F đƣợc thay bằng NH. Một điểm cần chú ý là ở đây có isomer ở C-
22 (khác với nhóm spirostan)
- Nhóm Solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này. Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N N O duong Solanin Hình 1.13. Solanin 1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của saponin
Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính trong các dƣợc liệu chữa ho nhƣ viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, sạch môn,… Một số dƣợc liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu nhƣ rau má, tỳ
giải, thiên môn, mạch môn… Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ tăng cƣờng sinh lực nhƣ nhân sâm, tam thất, ngũ gia bì, đinh lăng và một số cây thuốc họ nhân sâm khác. Saponin làm tăng sự thấm của tế bào, sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu. Một số có tác
dụng chống viêm nhƣ saponin cam thảo, ngƣu tất, cỏ xƣớc. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế hoạt động của virut nhƣ saponin cam thảo, lá cà chua, mầm khoai tây. Một số có tác dụng chống ung thƣ trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mền(nhuyễn thể).
Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tống hợp các thuốc steroid. Digitonin dùng để định lƣợng cholesterol. Saponin trong đậu nành cũng giống nhƣ phytate, hành xử nhƣ chất anti-oxidants để bảo vệ tế bào cơ thể chúng ta khỏi bị hƣ hại do tác dụng các gốc tự do. Nó cũng còn có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thƣ kết tràng và đồng thời làm giảm lƣợng cholesterol trong máu. Saponin trong nhân sâm làm tăng chuyển hóa lipid, theo các thí nghiệm, nhân sâm có thể ngăn ngừa sự phát sinh cholesterol cao ở thỏ, vì vậy mà ngăn ngừa đƣợc sựhình thành xơ vữa động mạch. Ngƣời ta đã khám phá ra những tác dụng của nhân sâm và các thành phần hóa học đơn lẻ của nó, dặc biệt là saponin (còn gọi là ginsenoside). Trong đó có một hoạt chất mang tên gọi là Ginsenoside Rh2- đây là một trong hơn 30 loại saponin có trong thành phần của Nhân sâm.
Saponin tam thất Việt Nam chứa chủ yếu saponin dammaran. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc hai saponin chủ yếu của Tam thất Việt Nam và
xác định chúng là ginsenosid- Rb1 và ginsenosid- Rg1. Saponin Rg có tác
dụng hƣng phấn trung khu thần kinh, có tác dụng chống mệt mỏi, tăng khả năng lao động trí óc và chân tay, nhƣng loại Saponin nhƣ Rb thì có tác dụng ức chế trung khu thầnkinh biểu hiện an thần gây ngủ [3,4].
25
1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật 1.3.1. Đặc điểm chung của chiết 1.3.1. Đặc điểm chung của chiết
Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó
Mục đích của chiết:
+ Chuyển một lƣợng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và đƣợc gọi là chiết làm giàu.
+ Ngoài ra còn dùng phƣơng pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thƣờng dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên.
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết
Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng.
Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA = CA / CB
KA: hằng số phân bố
CA, CB : nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn vào nhau.
1.3.3. Quá trình chiết
1.3.3.1. Chọn dung môi chiết
Trông thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nƣớc ít khi đƣợc quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để thu đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hƣởng tới hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết. Thƣờng có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
nhƣ các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyniat và tributylphotphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản nhƣ các thùng nhựa hoặc các nút nhựa.
Methanol và chloroform thƣờng chứa đioctylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ
bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của cloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ững với một vài hợp chất nhƣ các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm
khác. Tƣơng tự nhƣ vậy sự có mặt của lƣợng nhỏ axits clohidric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Vì chloroform có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên nó cần
đƣợc thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễbay hơi hơn chloroform.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
27
hòa tan phân lớp các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa
tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. thí dụ trechlonolide A thu đƣợc từ Trechonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense đƣợc chiết trong methanol nóng.
Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của methanol.
Đietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời có xu hƣớng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của đietyl êt dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo Cholesterol nhƣ các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazo thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân
tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazo có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong
cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không quá 30- 40oC, với một hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.3.2. Quá trình chiết
-Chiết ngâm
-Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. -Chiết sắc với dung môi nƣớc
-Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc
Chiết ngâm là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dƣới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách nửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhƣng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trƣớc đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng bằng thủy tinh.
Thông thƣờng quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng
pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết đƣợc lấy ra. Thế tahông thƣờng quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài
cách khác nhau. Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mỗi quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ
Phƣơng pháp sắc ký (chromatography) là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
29
1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1]
Sắc ký là phƣơng pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chũng giữa hai pha động và tĩnh.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và23 pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng ( tính bị hấp phụ, tính tan… ). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển