Trông thƣờng các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nƣớc ít khi đƣợc quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc những chất chuyển hóa thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên đƣợc chƣng cất để thu đƣợc dạng sạch trƣớc khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hƣởng tới hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết. Thƣờng có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
nhƣ các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetyniat và tributylphotphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản nhƣ các thùng nhựa hoặc các nút nhựa.
Methanol và chloroform thƣờng chứa đioctylphtalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ
bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của cloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ững với một vài hợp chất nhƣ các ankaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm
khác. Tƣơng tự nhƣ vậy sự có mặt của lƣợng nhỏ axits clohidric (HCl) cũng
có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nƣớc hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác. Vì chloroform có thể gây tổn thƣơng cho gan và thận nên nó cần
đƣợc thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt lạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễbay hơi hơn chloroform.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại khả năng phân cực của Chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
27
hòa tan phân lớp các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa
tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới đƣợc tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. thí dụ trechlonolide A thu đƣợc từ Trechonaetes aciniata đƣợc chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hydroxytropcocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense đƣợc chiết trong methanol nóng.
Ngƣời ta thƣờng ít sử dụng nƣớc để thu đƣợc dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nƣớc của methanol.
Đietyl ete hiếm khi đƣợc dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời có xu hƣớng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của đietyl êt dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo Cholesterol nhƣ các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có
thể tạo thành axetonit nếu 1,2 - cis - diol có mặt trong môi trƣờng axit. Quá trình chiết dƣới điều kiện axit hoặc bazo thƣờng đƣợc dùng với quá trình phân
tách đặc trƣng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazo có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong
cây đƣợc chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh đƣợc sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi đƣợc cất ra bằng máy cắt quay ở nhiệt độ không quá 30- 40oC, với một hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.3.3.2. Quá trình chiết
-Chiết ngâm
-Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. -Chiết sắc với dung môi nƣớc
-Chiết lôi cuốn theo hơi nƣớc
Chiết ngâm là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dƣới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách nửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhƣng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trƣớc đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhƣng hiện nay có thể dùng bằng thủy tinh.
Thông thƣờng quá trình chiết ngâm không đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng
pháp chiết liên tục bởi mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết đƣợc lấy ra. Thế tahông thƣờng quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết đƣợc xác định bằng một vài
cách khác nhau. Nhƣ vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mỗi quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phƣơng pháp sắc ký trong phân lớp các hợp chất hữu cơ
Phƣơng pháp sắc ký (chromatography) là một phƣơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
29
1.4.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký [1]
Sắc ký là phƣơng pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chũng giữa hai pha động và tĩnh.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và23 pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng ( tính bị hấp phụ, tính tan… ). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển
động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha động và pha tĩnh. Ởđiều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lƣợng chất bị hấp phụlên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc cới chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
N =
n- lƣợng chất bị hấp phụlên pha tĩnh lúc đạt cân bằng
- lƣợng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụnào đó
b- hằng số
C- nồng độ của chất bị hấp phụ
1.4.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký
Trong các phƣơng pháp sắc ký pha động là các lƣu thể ( các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm
lớn: sắc ký khí và sắc ký lớp mỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, ngƣời ta
chia ra thành các phƣơng pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (CC)
Đây là phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụlà pha tĩnh gồm các loại Silica gel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo
YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụđƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ
hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy
đƣợc ), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quang đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là
quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau của Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 1/30. Trong sắc ký cột, việc đƣa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa
31
thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên
cột. Nếu tách tinh, thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với dung lƣợng tối thiểu
Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột:
-Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụđƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.
-Cách 2: Nhồi cột ƣớt, tức là chất hấp phụđƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi
đủlƣợng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối loạn trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột
không đƣợc nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định
hƣớng cho sắc kí cột. SKLM đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản đƣợc tráng
Silica gel dày hơn ), có thểđƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, ngƣời ta có thế cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể
phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc
1.5. Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [1] cơ [1]
Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào các
phƣơng pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà
ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phổi hợp các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, ngƣời ta phải dựa vào
các phƣơng pháp phổ bổsung khác nhƣ chuyển hóa hóa học, kết hợp với các
phƣơng pháp sắc ký so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại đƣợc xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dƣới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết đƣợc đặc trƣng bởi một vùng bƣớc sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thểxác định đƣợc các nhóm chức đặc trƣng trong hợp chất, ví dụ nhƣ dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700 1750 cm-1 ...
1.5.2. Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion trong phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lƣợng, những phƣơng pháp chủ yếu đƣợc nêu ra dƣới đây:
-Phổ EI-MS (Electron Impact Ionizatoin mass spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lƣợng khác nhau, phổ biến là 70eV.
-Phổ ESI-MS (Electron spray Ionizatoin mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn
33
nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là pic ion phân tử và các
pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ bị phá vỡ. -Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lƣợng thấp, do đó
phổthu đƣợc cũng dễthu đƣợc pic ion phân tử.
-Phổ khối lƣợng phân giải cao (High resolution mass spectroscopy) cho
phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
-Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc ký kết hợp với khối phổ khác nhƣ: GC-MS (sắc kí khí- khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng- khổi phổ). Các phƣơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong
ngành dƣợc).
1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) Spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thểxác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng
độ chuyển dịch hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trƣng của phân tử còn
đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ1H- NMR:
Trong phổ 1
H-NMR, độ chuyển dịch hóa học ( ) của các proton đƣợc
nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trƣng
của độ chuyển dịch hóa học và tƣơng tác spin mà ngƣời ta có thể xác định
đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất.