Đây là phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụlà pha tĩnh gồm các loại Silica gel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo
YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụđƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ
hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hoặc khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy
đƣợc ), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quang đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là
quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy thuộc vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau của Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 1/30. Trong sắc ký cột, việc đƣa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa
31
thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên
cột. Nếu tách tinh, thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với dung lƣợng tối thiểu
Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột:
-Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụđƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.
-Cách 2: Nhồi cột ƣớt, tức là chất hấp phụđƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi
đủlƣợng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối loạn trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột
không đƣợc nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.