Quy trình phân tích dữ liệu hệ gen bao gồm 4 bước chính: 1) Kiểm tra chất lượng dữ liệu; 2) Sắp hàng trình tự với hệ gen tham chiếu; 3) Xác định các biến thể di truyền dạng điểm hoặc các đoạn chèn/xóa ngắn; 4) Chú giải chức năng và mối liên hệ với kiểu hình của các biến thể di truyền.
Kiểm tra chất lượng dữ liệu: Đối với nền tảng Illumina Hiseq, chất lượng nucleotit được đánh giá thông qua điểm chất lượng Phred, tính bằng công thức: 𝑄 = −10 𝑙𝑜𝑔10𝑃. Trong đó, P là xác suất nucleotit đó bị sai. Tương tự, điểm Phred cũng dùng để đánh giá chất lượng của các đoạn đọc ngắn và dựa trên điểm chất lượng của từng nucleotit trong đoạn. Thông thường, điểm chất lượng từ 30 trở lên được coi là có
độ tin cậy cao.
Sắp hàng trình tự: Dữ liệu đầu vào là bộ gen tham chiếu và bộ dữ liệu bộ gen
đưa ra từ máy giải trình tự. Các đoạn ngắn ADN được sắp xếp theo hệgen người tham chiếu phiên bản hg38 bằng 2 công cụ được sử dụng rộng rãi hiện nay là Burrows –
Wheeler Aligner (BWT) [40] và Bowtie-2 [36].
Xác định biến thể di truyền: Dữ liệu đầu vào là các đoạn ngắn ADN đã được
xác định vị trí trên hệ gen tham chiếu. Các SNP và chèn/xóa đoạn ngắn < 50 bp được
xác định bằng mô hình kết hợp 2 cách sắp hàng trình tự và 3 thuật toán thống kê GATK [56], Platyplus [94] và Freebayes.
Chú giải biến thể: Phần mềm Annovar [93] được sử dụng để dựđoán loại biến thể, tác động của biến thểđến cấu trúc và chức năng của protein tương ứng. Cuối cùng, khả năng gây bệnh của biến thể được chú giải dựa vào CSDL về đột biến gen người (Human genome mutation database) [82].
24
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng
3.1.1. Thông tin chung và khám lâm sàng
Bệnh nhân nữ 19 tuổi đến bệnh viện vì khó thở khi gắng sức và đau thắt ngực. Triệu chứng xuất hiện lần đầu khi cô 10 tuổi và đã được chẩn đoán mắc BCTPĐ bằng siêu âm tim ở tuổi 11. Bố bệnh nhân 53 tuổi được phát hiện mắc BCTPĐ sau khi tham gia vào nghiên cứu này và chỉ bị khó thở nhẹ khi gắng sức. Mẹ bệnh nhân 50 tuổi và chị
gái bệnh nhân 26 tuổi không có bất cứ triệu chứng nào và được chẩn đoán không mắc
BCTPĐ.Cả4 thành viên trong gia đình này đều không có tiền sử ngất hoặc tiền ngất. Tại thời điểm khám lâm sàng, nhịp tim của bệnh nhân được ghi nhận là 65 nhịp/phút, nhịp tim của bố bệnh nhân là 90 nhịp/phút. Huyết áp đo được của bệnh nhân là 120/80 mmHg, huyết áp của bố bệnh nhân là 140/80 mmHg.
3.1.2. Dữ liệu cận lâm sàng
Tổng hợp dữ liệu cận lâm sàng của bốn đối tượng được trình bày trong Bảng 3.1.
Kết quả cận lâm sàng của mẹ và chị gái bệnh nhân bình thường, trong khi bệnh nhân và bố có những bất thường về hình thái và chức năng cơ tim. Siêu âm tim cho thấy bệnh
nhân phì đại thành thất trái với với vị trí dày nhất đo được là 28,36 mm, dấu hiệu vận
động bất thường ra trước của lá trước van hai lá thì tâm thu, hở van hai lá nhẹ và giãn
tâm nhĩ trái nặng. Kết quả siêu âm tim của bố bệnh nhân nghi ngờphì đại vách liên thất giữa với độ dày thành tối đa là 14,26 mm. Đánh giá CMR xác nhận chứng phì đại cơ tim
trên bệnh nhân và bố bệnh nhân với độ dày thành thất trái đo được lần lượt là 20,2 mm và 15,0 mm. Bệnh nhân được xác định phì đại cơ tim với kiểu hình loại II, bố bệnh nhân
phì đại cơ tim với kiểu hình loại I theo phân loại của Maron B.J [48].
Bảng 3.1. Dữ liệu cận lâm sàng của các đối tượng
Bệnh nhân Bố Mẹ Chị gái Điện tâm đồ ĐTĐ 12 chuyển đạo ST chênh xuống ở V4-V6 Block nhánh phải Block nhĩ thất độ 1 Bình thường Bình thường
25
Holter ĐTĐ 24 giờ Rung nhĩ kịch phát Nhịp nhanh thất không kéo dài Nhịp nhanh thất không kéo dài - -
Siêu âm tim
Độ dày thành tối đa
(mm) 28,36 14,26 7,3 6,5 Độchênh áp đường ra thất trái (mmHg) 7,9 0 0 0 Rối loạn chức năng tâm trương Độ I Độ II Không Không LVEF (%) 63 56 65 67 CMR
Độ dày thành tối đa
(mm)
20,2 15,0 - -
LVEF (%) 57,9 56,9 - -
Kiểu hình Loại II Loại I - -
Hình thái thất trái Bất thường Bất thường - - Tín hiệu muộn với
Gadolinium
Có Có - -
Quản lý
Chẩn đoán BCTPĐ BCTPĐ Bình thường Bình thường
Điều trị Chẹn beta
Acenocoumarol
Chẹn beta Không Không
3.2. Dữ liệu hệ gen
3.2.1. Dữ liệu hệgen liên quan đến BCTPĐ
Thông qua WGS, 22 gen nhạy cảm BCTPĐ và 13 gen liên quan đến sao hình
BCTPĐ (Bảng 3.2) đã được phân tích. Kết quả phân tích các gen này cho thấy bệnh nhân và bố mình cùng mang kiểu gen dị hợp tử c.G2308A (p.Asp770Asn) trong exon 22 của gen MYBPC3. Ngoại trừđột biến c.G2308A trên gen MYBPC3, không có đột biến
26
nào được xác định trong 34 gen còn lại ở cả 4 bệnh nhân. Kết quả giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger đã xác nhận sự hiện diện của dạng biến thểMYBPC3ở bệnh nhân và bố bệnh nhân (Hình 3.5). Hai phương pháp giải trình tự này cho kết quả tương đồng, chứng tỏphương pháp giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu này có độ chính xác cao và các biến thể phát hiện được bằng giải trình tự thế hệ mới là đáng tin cậy.
Bảng 3.2. Gen liên quan đến BCTPĐ được phân tích trong nghiên cứu Gen Locus Protein Kết quả Sợi dày
1. MYH7 14q11.2–q12 Chuỗi nặng β-myosin BT
2. MYL2 12q23–q24.3 Chuỗi nhẹ myosin 2 BT
3. MYL3 3p21.2–p21.3 Chuỗi nhẹ myosin 3 BT
4. MYH6 14q11.2–q12 Chuỗi nặng α-myosin BT
5. TTN 2q24.3 Titin BT
Sợi mỏng
6. ACTC 15q14 α-actin cơ tim BT
7. TNNC1 3p21.3–p14.3 Troponin C1 BT
8. TNNI3 19p13.4 Troponin I3 BT
9. TNNT2 1q32 Troponin T2 BT
10. TPM1 15q22.1 α-tropomyosin BT
Sợi trung gian
11. MYBPC3 11p11.2 Protein C liên kết myosin BN và bố BN có biến thể c.G2308A (rs36211723) 12. LMNA 1q22 Lamin BT Đĩa Z 13. ACTN2 1q42–q43 α-actinin 2 BT
14. CSRP3 11p15.1 Protein LIM của tim BT
15. LBD3 10q22.2–q23.3 Miền liên kết LIM 3 BT
16. MYOZ2 4q26–q27 Myozenin 2 BT
27 18. TCAP 17q12–q21.1 Telethonin BT 19. VCL 10q22.1–q23 Vinculin/metavinculin BT Quản lý canxi 20. CASQ2 1p13.1 Calsequestrin 2 BT 21. JPH2 20q12 Junctophilin-2 BT 22. PLN 6q22.1 Phospholamban BT Sao hình BCTPĐ 23. TAZ Xq28 Tafazzin BT 24. DTNA 18q12 α-dystrobrevin BT
25. PRKAG2 7q35–q36.36 Protein kinase hoạt hóa AMP BT
26. LAMP2 Xq24 Protein màng liên kết với
lysosom 2 BT 27. GAA 17q25.2–q25.3 Alpha-1,4-glucosidase BT 28. GLA Xq22 Alpha-galactosidase A BT 29. AGL 1p21 Amylo-1,6-glucosidase BT 30. FXN 9q13 Frataxin BT
31. PTPN11 12q24.1 Tyrosine phosphatase không
thụ thể tuýp 11
BT
32. RAF1 3p25 Protein kinase serin/threonin BT
33. KRAS 12p12.1 GPTase tương đồng gen sinh
ung KRAS
BT
34. SOS1 2p22-p21 Yếu tố trao đổi guanin cho
protein RAS
BT
35. TTR 18q12.1 Transthyretin BT
BN: Bệnh nhân; BT:Bốn đối tượng đều bình thường, không phát hiện đột biến.
Hình 3.1. Kết quả giải trình tự Sanger vùng gen MYBPC3 của bệnh nhân (A) và bố bệnh nhân (B). Mũi tên đỏ chỉ vịtrí đột biến c.G2308A
28
3.3.2. Dữ liệu hệgen liên quan đến các vấn đề sức khỏe khác
Thông qua WGS, không chỉcác gen liên quan đến BCTPĐ, dữ liệu về bất cứ gen
nào cũng có thểđược trích xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn trích xuất dữ
liệu và chú giải kiểu gen của 41 gen liên quan đến một số vấn đề sức khỏe khác, bao gồm 12 gen liên quan đến một số bệnh lý tim mạch khác, 15 gen liên quan bệnh ung thư
có tính di truyền, 5 gen liên quan đến bệnh di truyền đơn gen thể lặn, 4 gen liên quan
đến dinh dưỡng và chuyển hóa, 2 gen liên quan đến tập luyện thể dục thể thao, 2 gen liên
quan đến bệnh chuyển hóa và 1 gen liên quan đến đáp ứng thuốc (Bảng 3.3). Ở cả bốn thành viên, không phát hiện các biến thể gây bệnh tim mạch khác, ung thư và bệnh di truyền đơn gen thể lặn. Các biến thể ảnh hưởng đến luyện tập thể dục thể thao là rs1815739 (gen ACTN3) và rs1130864 (gen CRP). Trong đó, bệnh nhân và mẹ mang kiểu gen dị hợp ởrs1815739, liên quan đến tiềm năng vận động thể chất khác với bố và chị gái. Cảgia đình này đều có nguy cơ cao bị viêm xương khớp với kiểu gen đồng hợp
đột biến ở rs143383 thuộc gen GDF5. Bệnh nhân có kiểu gen dị hợp đột biến tại rs1801133 (gen MTHFR) làm tăng nguy cơ thiếu hụt vitamin B12 và axit folic. Ngoại trừ mẹ bệnh nhân, ba thành viên còn lại có kiểu gen dị hợp ở rs12979860 (gen IFNL3)
gây ra đáp ứng kém với thuốc alfa peginterferon.
Bảng 3.3. Đa hình liên quan đến một số vấn đề sức khỏe khác của các đối tượng Gen đã phân tích (SNP) Kiểu gen Nhận xét BN Bố Mẹ Chị gái Bệnh lý tim mạch Bệnh nhịp nhanh thất do catecholamin RYR2 - - - - BT Bệnh cơ tim thất phải gây loạn nhịp PKP2; DSP; DSC2; DSG2; TMEM43 - - - - BT Hội chứng QT dài Hội chứng Brugada KCNQ1; KCNH2; SCN5A - - - - BT Bệnh tăng cholesterol máu gia đình LDLR; APOB; PCSK9 - - - - BT Ung thư
29
Ung thư vú BRCA1; BRCA2; TP53;PTEN; STK11; CDH1
- - - - BT
Ung thư buồng trứng BRCA1; BRCA2; MLH1; MSH2; STK11
- - - - BT
Ung thư tử cung MLH1; MLH2; MSH6; PMS2; PTEN; STK11 - - - - BT Ung thư đại trực tràng MLH1; MSH2; MSH6; PMS2; APC; MUTYH; STK11; BMPR1A; SMAD4 - - - - BT
Ung thư tuyến giáp PTEN - - - - BT
Ung thư dạ dày MLH1; MSH2; STK11; BMPR1A; SMAD4
- - - - BT
Ung thư tụy STK11; BRCA2 - - - - BT
Bệnh di truyền đơn gen thể lặn
Thiếu máu beta- thalassemia HBB - - - - BT Bệnh xơ nang CFTR - - - - BT Bệnh tăng sản thượng thận CYP21A2 - - - - BT Bệnh Wilson ATP7B - - - - BT
Bệnh thiếu hụt citrin SLC25A13 - - - - BT
Dinh dưỡng và chuyển hóa
Vitamin B2 và axit folic MTHFR (rs1801133) CT CT - TT TT: nguy cơ cao thiếu hụt Vitamin C SLC23A1 - - - - BT Vitamin D GC - - - - BT
30 Cafein CYP1A2 (rs762551) CA - CA - CA: chuyển hóa chậm Tập luyện thể dục thể thao Kiểu luyện tập ACTN3 (rs1815739) TT CT TT CT CT: sức mạnh; TT: sức bền Khảnăng hồi phục CRP (rs1130864) GG GA GA GA BT Bệnh chuyển hóa
Viêm xương khớp GDF5 (rs143383) AA AA AA AA Nguy cơ cao
Tiểu đường tuýp 2 TCF7L2 - - - - BT
Đáp ứng thuốc Peginterferon α-2a Peginterferon α-2b IFNL3 (rs12979860) CT CC CT CT CT: đáp ứng kém
31
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng
4.1.1. Thông tin chung
BCTPĐ di truyền trên nhiễm sắc thểthường nên nam và nữđều có nguy cơ mắc bệnh tương đương nhau. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy có sự khác biệt về biểu hiện lâm sàng, tiến triển và tiên lượng bệnh giữa nam và nữ. Nữ giới có tuổi trung bình lúc chẩn đoán bệnh lần đầu cao hơn, biểu hiện triệu chứng lâm sàng thường xuyên, tiên
lượng xấu và tỷ lệ sống thấp hơn nam giới [28, 91]. Tiến triển bệnh nặng hơn ở nữ giới bao gồm tắc nghẽn đường ra thất trái, hở van hai lá nhiều hơn; rối loạn chức năng tâm trương, tăng áp động mạch phổi nặng hơn; hoạt động gắng sức tim phổi kém hơn nam
giới. Tương đồng với các nghiên cứu trước đó, trong nghiên cứu này của chúng tôi, bệnh nhân nữ có triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng hơn so với bố cô, biểu hiện bằng khó thở
nhiều hơn đi kèm với đau thắt ngực. Các kết quả cận lâm sàng cũng cho thấy bệnh nhân nữ tiến triển bệnh nặng hơn và tiên lượng có xu hướng xấu hơn so với bố cô.
So sánh với tuổi trung bình lúc chẩn đoán BCTPĐ là 49,5 tuổi theo nghiên cứu của Adalsteinsdottir và cs [3] hay 50,7 tuổi theo nghiên cứu của Sheikh và cs [77], bệnh nhân nữ trong nghiên cứu này khởi phát bệnh và được chẩn đoán từ rất sớm. BCTPĐ là
một bệnh lý di truyền biểu hiện ởgia đoạn trưởng thành nhiều hơn là ởgiai đoạn trẻ nhỏ. Theo thống kê tại Mỹ từnăm 2001 đến năm 2014, tỷ lệ trẻ em nhập viện vì BCTPĐ là
0,22 ca/10.000 trẻ/ năm, tuy nhiên cao hơn ở nhóm trẻ 10 - 18 tuổi (0,31 ca) [74]. Các nghiên cứu cho thấy rằng BCTPĐ ở trẻ em và thanh thiếu niên có tiến triển nhanh hơn, đồng thời tỷ lệ vong của nhóm trẻ em có triệu chứng cao hơn so với người lớn [5, 74]. Giống như bố bệnh nhân, phần lớn bệnh nhân BCTPĐ được phát hiện bệnh tương đối muộn, do diễn biến bệnh từ từ, triệu chứng không điển hình hoặc thậm chí không có triệu chứng nên dễ dàng bị bỏ qua [47].
4.1.2. Khám lâm sàng
Bệnh nhân có những triệu chứng điển hình nhất của BCTPĐ, bao gồm khó thở
khi gắng sức và đau thắt ngực. Nhiều nghiên cứu khác chứng minh đây là những triệu chứng cơ năng thường gặp nhất ở bệnh nhân BCTPĐ. Trong tổng số 425 bệnh nhân tham gia nghiên cứu của Sheikh và cs, khó thở xuất hiện ở 198 bệnh nhân (47%), đau thắt ngực xuất hiện ở 194 bệnh nhân (45,6%) [77]. Đau thắt ngực là biểu hiện thường gặp
32
thứ hai sau khó thở khi nó được báo cáo ở 25 - 30% bệnh nhân mắc BCTPĐ theo nghiên
cứu của Elliott và nghiên cứu của Pasternac [21, 68].
Trái ngược với bệnh nhân có biểu hiện điển hình, bố của bệnh nhân hầu như
không có triệu chứng, chỉ bị khó thở nhẹ khi gắng sức và chỉ được phát hiện bệnh sau khi tham gia vào nghiên cứu này. Trường hợp bệnh nhân BCTPĐ không có triệu chứng
như vậy khá phổ biến và đôi khi, đột tử có thể là biểu hiện đầu tiên của bệnh. Trong nghiên cứu thực hiện trên 4111 đối tượng của Maron, đa số bệnh nhân BCTPĐ không
có triệu chứng và chỉđược phát hiện một cách tình cờ thông qua các lần khám sức khỏe
định kỳ [47]. BCTPĐ không triệu chứng gây ra khó khăn trong việc phát hiện bệnh, phân tầng nguy cơ và đưa ra chiến lược quản lý bệnh hiệu quả.
4.1.3. Dữ liệu cận lâm sàng 4.1.3.1. Điện tâm đồ 4.1.3.1. Điện tâm đồ
Trong chẩn đoán BCTPĐ, ĐTĐ là một công cụ có giá trị vì nó giúp phát hiện phì
đại thất trái, sóng điện tim bất thường và gợi ý kiểm tra thêm siêu âm tim hoặc CMR. Bệnh nhân và bố bệnh nhân đều có những thay đổi bất thường trên ĐTĐ nhưng những
thay đổi của bệnh nhân thường gặp hơn so với bố bệnh nhân. Theo nghiên cứu của Mcleod và cs, 94% bệnh nhân BCTPĐ có những đặc điểm bất thường trên ĐTĐ [57].
Các đặc điểm bất thường phổ biến trên ĐTĐ của bệnh nhân BCTPĐ bao gồm phì đại thất trái, sóng ST-T không đặc hiệu và sóng Q bất thường, trong khi block nhánh hoàn
toàn tương đối hiếm gặp. Trong số 425 bệnh nhân BCTPĐ tham gia nghiên cứu của Sheikh và cs, 93% bệnh nhân có dấu hiệu bất thường trên ĐTĐ; 73,4% bệnh nhân có sóng T đảo ngược ở chuyển đạo bên; 48,9% bệnh nhân có ST chênh xuống; 43,1% bệnh nhân có dấu hiệu lớn thất trái trên ĐTĐ và chỉ 4,2% bệnh nhân có block nhánh [77].
Đánh giá holter ĐTĐ 24 giờ rất hiệu quả trong phát hiện các rối loạn nhịp tim của
BCTPĐ. Bất thường nhịp tim ở bệnh nhân và bố bệnh nhân bao gồm rung nhĩ kịch phát và nhịp nhanh thất không kéo dài đã được báo cáo ở nhiều bệnh nhân BCTPĐ khác [2,