2.3.4.1.Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử: 5 mẫu dịch chiết MeOH tương ứng các mẫu S, AG, AC, B, C như trên Mẫu đối chiếu:
- emodin: hòa tan 20mg emodin 98.25% bằng EtOH trong bình định mức 5ml được dung dịch có nồng độ C₀ =3.93mg/ml (hay 3.93µg/µl)
- physcion: hòa tan 5mg physcion 98.12% bằng EtOH trong bình định mức 5ml được dung dịch có nồng độ C₀ =0.98mg/ml (hay 0.98µg/µl)
2.3.4.2.Khảo sát khoảng tuyến tính
Bản mỏng Silicagel GF254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ được chia thành 5 băng. Chấm lần lượt mỗi băng theo thứ tự thể tích tăng dần 15µl, 25µl, 50µl, 75µl, 100µl, chấm thành vạch dài 32mm.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0,5)
Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung môi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định các vết emodin và physcion.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch trong, pha loãng 3 lần đối với emodin, tiến hành đo quang ở bước sóng 250nm [10].
Lập đường tuyến tính của độ hấp thụ theo nồng độ đối với mỗi dung dịch chất đối chiếu.
19
2.3.4.3.Thẩm định tính phù hợp của hệ thống
Bản mỏng Silicagel F254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ được chia thành 6 băng. Chấm lần lượt mỗi băng 50µl dung dịch chất đối chiếu, chấm thành vạch dài 24mm.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0.5)
Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung môi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định các vết emodin và physcion.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch trong, pha loãng 3 lần đối với emodin, tiến hành đo quang ở bước sóng 250nm [10].
Xử lý số liệu, kiểm tra độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu.
2.3.4.4.Định lượng một số thành phần
Bản mỏng Silicagel GF254 (20cm x 10cm) hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ chia thành các băng. Chấm riêng biệt lên bản mỏng một thể tích phù hợp các dung dịch thử tương ứng các mẫu S, AG, AC, B, C.
Hệ dung môi: Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0.5)
Tiến hành triển khai sắc ký, khi dung môi đi được khoảng 8cm thì lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí, quan sát dưới đèn UV 366nm, khoanh vết để xác định các vết tương ứng với các chất cần định lượng.
Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu, cho mỗi mẫu bột silicagel vào bình định mức 5ml, bổ sung MeOH đến vạch, siêu âm 30 phút. Ly tâm, gạn lấy dịch trong, tiến hành đo quang ở bước sóng thích hợp (250 nm đối với emodin và physcion, 320 nm đối với 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid [10])