Các số liệu thu được được xử lý bằng Microsoft Excel. Giá trị trung bình TB: Hàm AVERAGE.
Độ lệch chuẩn SD: Hàm STDEV.
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = TBSD * 100
Xây dựng đường tuyến tính bằng tính năng Charts trong Excel, kết quả đo độ hấp thụ quang áp dụng vào phương trình tuyến tính để tính nồng độ các chất.
20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1.Kiểm tra nguyên liệu đầu vào
Cảm quan: củ tròn hay hình thoi, to nhỏ không đều, mặt ngoài nâu đỏ, ruột đỏ hồng, có những nếp nhăn sâu, chất chắc, khó bẻ. Giống với mô tả và hình ảnh theo chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V [3].
Độ ẩm: 9.3%. Độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (phụ lục 9.6, 1g, 105°C, 5h).
Sắc ký lớp mỏng: Để đánh giá thành phần hóa học của nguyên liệu, tiến hành sắc ký lớp mỏng giữa dịch chiết từ dược liệu sống với mẫu Hà thủ ô đỏ chuẩn và một vài chất đối chiếu. Kết quả cho thấy dược liệu có các vết tương ứng với các chất đối chiếu.
Như vậy nguyên liệu có thể sử dụng được cho nghiên cứu này.
Hình 3.1. Sắc kí đồ dược liệu sống và các chất đối chiếu
(Chú thích: Ch: Hà thủ ô đỏ chuẩn, S: Hà thủ ô đỏ sống, Ph: physcion, Em: emodin, Ag: acid gallic, St: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid)
3.2.Chế biến Hà thủ ô đỏ theo phương pháp cổ truyền
Tiến hành chế chế biến Hà thủ ô đỏ theo 3 phương pháp như đã trình bày ở mục
2.3.1.
- Mẫu chế theo Dược điển Việt Nam V (A): sử dụng 1.2kg củ khô, ngâm nước vo gạo 2 ngày, 150g đậu đen nấu lấy 1.5l nước, nấu Hà thủ ô đỏ cùng đậu đen trong 6 giờ
- Mẫu chỉ chế với đậu đen (B): sử dụng 800g củ khô, 200g đậu đen, nấu trrong 6 giờ - Mẫu chế rượu (C): sử dụng 1.1kg củ khô, 130g đậu đen nấu lấy 350ml dịch, 350ml rượu nếp (37º), nấu đến khi dịch cạn (3.5 giờ)
21
Bảng 3.1. Khối lượng và hàm ẩm các mẫu Hà thủ ô đỏ thu được sau chế biến
Mẫu
A
B C
AG AC
Khối lượng dược liệu sống (g) 1200 800 1100
Khối lượng sau chế biến (g) 320 780 760 1020
Hàm ẩm 6.7% 6.0% 2.5%
* Nhận xét và bàn luận:
Khi bỏ qua thời gian ở các công đoạn phụ trợ như chuẩn bị nguyên vật liệu, thái, sấy thì thời gian chế biến của phương pháp chế theo DĐVN V (A) là dài nhất (2 ngày ngâm+6 giờ nấu), sau đó là phương pháp chỉ chế với đậu đen (B) (6 giờ nấu), và ngắn nhất là phương pháp chế rượu (C) (3.5 giờ nấu), C cũng là phương pháp ít tác động nhiệt hơn (đun cách thủy) so với 2 phương pháp còn lại. Khối lượng dược liệu trước và sau chế biến có sự hao hụt nhưng thay đổi không đáng kể. Hàm ẩm trong dược liệu chế biến hoàn thiện đều nhỏ hơn 12.0%.
Về màu sắc, nhìn chung, dược liệu sau chế biến có màu đậm hơn so với dược liệu sống, riêng mẫu ngâm nước vo gạo có màu nhạt nhất. Điểm chung của cả 3 phương pháp này là đều sử dụng phụ liệu đậu đen. Có thể thấy màu sắc được tăng cường bởi phụ liệu đỗ đen. Điều này phù hợp với học thuyết ngũ hành trong Y học cổ truyền khi chế Hà thủ ô đỏ với đỗ đen (màu đen thuộc hành thủy) để tăng dẫn thuốc vào kinh thận.
3.3.Định tính một số thành phần hóa học bằng TLC
Sau khi đã có các mẫu dược liệu sống và chế biến, tiến hành chuẩn bị dịch chiết tương ứng với các mẫu S, AG, AC, B, C. Ban đầu tiến hành khảo sát tỉ lệ dược liệu : dung môi (g:ml) bằng cách sắc ký lớp mỏng với mẫu thử là dịch chiết dược liệu sống với tỉ lệ 1:1, 2:1, 4:1 (Hình 3.2) và thấy rằng tỉ lệ 1g dược liệu : 1ml MeOH cho các vết tách rõ nét nhất. Vì vậy tỉ lệ 1g dược liệu : 1ml MeOH được lựa chọn để tiến hành chuẩn bị dịch chiết mẫu như ở mục 2.3.2.
Với các mẫu dịch chiết đã được chuẩn bị, có thể quan sát thấy rằng trong các mẫu dịch chiết của dược liệu sau chế biến, mẫu chế theo DĐVN (AC) cho thể chất dịch chiết tốt nhất, trong và ít đặc hơn các mẫu còn lại. Các mẫu còn lại sánh và đậm màu
22
hơn, đặc biệt là mẫu chế rượu (C). Điều này có thể gây khó khăn trong quá trình triển khai sắc ký.
Để khảo sát hệ dung môi pha động, tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với mẫu thử của dược liệu sống và dược liệu chế (Hình 3.3). Kết quả cho thấy hệ (1) tách được hầu hết các vết, các vết emodin, physcion, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D- glucosid, acid gallic tách riêng biệt nhau với khoảng cách vừa phải, nhưng vết 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid có Rf hơi thấp và gần sát vết lân cận. Hệ (2) cho vết 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid có Rf cao hơn hệ (1) và tách hoàn toàn khỏi các vết khác nhưng vết emodin và physcion quá gần nhau. Hệ (3) không tách được rõ các vết. Hệ (4) cho hai vết emodin và physcion tách xa nhau nhưng lại không quan sát được vết acid gallic và 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid. Trong 4 hệ dung môi đã khảo sát, hệ (1) cho sắc ký đồ có nhiều vết nhất, các vết tách xa nhau. Do đó, hệ (1) Toluen: EtOHtđ: Acid Aceticbăng (8: 2: 0.5) được lựa chọn làm hệ dung môi pha động để tiến hành sắc ký lớp mỏng.
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ với các mẫu thử và các mẫu dung dịch đối chiếu. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.4.
Trên sắc kí đồ, các mẫu đối chiếu emodin (Em), physcion (Ph), 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid (St), acid gallic (Ag) đều cho một vết rõ nét. Dưới ánh sáng 366nm, emodin có màu vàng đậm, physcion có màu vàng nhạt, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid có màu xanh dương, acid gallic có màu xanh than khó quan sát nhưng ở ánh sáng 254nm thì rõ nét. Các mẫu thử đều cho các vết emodin, physcion, 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid và acid gallic có cùng màu sắc và Rf tương đương với các mẫu đối chiếu. Đối với physcion, các mẫu chế đều cho vết rõ nét hơn mẫu sống, trong đó mẫu ngâm nước vo gạo (AG) và mẫu chế theo DĐVN (AC) rõ nhất. Đối với emodin, các mẫu chế cũng cho vết rõ nét hơn mẫu sống, trong đó mẫu chỉ chế với đậu đen (B) đậm nhất và mẫu chế rượu (C) có vẻ nhạt hơn. Đối với 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, các mẫu chế cũng cho vết rõ nét hơn mẫu sống nhưng không chênh lệch quá nhiều như hai vết emodin và physcion, giữa các mẫu chế không khác nhau quá nhiều, mẫu chế rượu (C) có hiện tượng kéo chân nên vết 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid không tách gọn như các mẫu còn lại. Đối với acid gallic, mẫu chế theo DĐVN (AC)cho vết nhạt hơn so với các mẫu còn lại, giữa các mẫu còn lại không khác nhau nhiều. Ngoài 4 chất trên,
23
chúng tôi cũng nhận thấy sự biến đổi ở một số vết khác, ví dụ như vết màu xanh ngọc ở ngay dưới vết physcion hay vết màu cam ngay dưới vết emodin…., tuy nhiên chúng tôi vẫn chưa xác định được các chất này.
Hình 3.2. Khảo sát tỉ lệ dược liệu : dung môi
24
Hình 3.4. Sắc kí đồ định tính các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến
(Chú thích: Em: emodin, Ph: physcion, St: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D- glucosid, Ag: acid gallic
25
Nhìn chung có thể thấy rằng, quá trình chế biến đã làm giàu hàm lượng các thành phần như Emodin, Physcion, 2,3,5,4′-Tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, trong đó anthraquinon tự do (Emodin, Physcion) tăng đáng kể. Tanin giảm nhiều nhất ở mẫu AC, điều này phù hợp với lý thuyết Y học cổ truyền khi ngâm với nước vo gạo để loại tanin (mẫu B và C đều không ngâm ước vo gạo) hoặc cũng có thể do quá trình chế biến kéo dài làm giảm tanin nhiều hơn. Vì 2 hợp chất nhóm anthraquinon cho thấy sự biến đổi rõ ràng nhất nên chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp để định lượng chúng.
3.4.Đánh giá sự biến đổi một số thành phành hóa học bằng TLC-UV
3.4.1. Đánh giá sự biến đổi của emodin và physcion
3.4.1.1.Xây dựng phương pháp
a) Khảo sát khoảng tuyến tính của emodin:
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như đã trình bày ở mục 2.3.4.2 đối với dung dịch chất đối chiếu emodin nồng độ C₀ 3.93µg/µl. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở
Hình 3.5.
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết emodin cho màu vàng đậm, các vết gọn, rõ nét, không có vết lạ, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính emodin
STT 1 2 3 4 5
Vch (µl) 15 25 50 75 100
mđ (µg) 19.65 32.75 65.50 98.25 131.00
A 0.171 0.259 0.414 0.647 0.823
Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ=𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
3 (µg)
26
27
Từ kết quả trên xây dựng được đường tuyến tính (Hình 3.6) với: Phương trình đường tuyến tính: Y = 0.0059*X + 0.0551
Trong đó: Y: độ hấp thụ quang X: lượng chất emodin
Hình 3.6. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo lượng chất emodin
Phương trình đường tuyến tính của emodin có hệ số tương quan R = 0.998 đảm bảo thực hiện phép định lượng với nồng độ emodin trong khoảng tuyến tính 19.65 – 131.00 (µg/ml).
b)Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - emodin
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.4.3 đối với dung dịch chất đối chiếu emodin nồng độ C₀ 3.93 µg/µl. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.7.
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết emodin cho màu vàng đậm, các vết gọn, rõ nét, không có vết lạ, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.3. y = 0,0059x + 0,0551 R² = 0,9965 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 Độ hấp thụ quang A Lượng chất emodin m (µg) Đường tuyến tính emodin
28
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - emodin
STT Vch (µl) mđ (µg) A 1 50 65.50 0.435 2 50 65.50 0.449 3 50 65.50 0.483 4 50 65.50 0.448 5 50 65.50 0.453 6 50 65.50 0.464 TB 0.455 SD 0.015 RSD (%) 3.3 Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ=𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
3 (µg)
A: Độ hấp thụ quang
Kết quả thu được RSD = 3.3% < 5.0%, cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của phép đo nhỏ, phương pháp phù hợp và có thể áp dụng để định lượng emodin.
29
30 c) Khảo sát khoảng tuyến tính của physcion
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.4.2 đối với dung dịch chất đối chiếu physcion nồng độ C₀ 0.98 (µg/µl). Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.8.
31
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366 nm các vết physcion cho màu vàng nhạt, các vết gọn, rõ nét, Rf tương đương nhau, có một vài vết lạ nhưng các vết rất nhạt tách hoàn toàn với vết physicon.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250 nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.4:
Bảng 3.4. Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính physcion
STT 1 2 3 4 5
Vch (µl) 15 25 50 75 100
mđ (µg) 14.70 24.50 49.00 73.50 98.00
A 0.230 0.339 0.353 0.484 0.560
Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: Độ hấp thụ quang
Từ kết quả trên xây dựng được phương trình đường tuyến tính Y = 0.0037*X + 0.2032 (Hình 3.9) với hệ số tương quan R = 0.970 (trong đó Y: độ hấp thụ quang, X: nồng độ physcion). Có thể thực hiện phép định lượng physcion với nồng độ physcion trong khoảng 14.70 - 98.00 (µg/ml).
Hình 3.9. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo lượng chất physcion
d)Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - physcion
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như đã trình bày ở mục 2.3.4.3 đối với dung dịch chất đối chiếu physcion nồng độ C₀ 0.98µg/µl thu được kết quả như Hình 3.10
y = 0,0037x + 0,2032 R² = 0,9424 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Độ h ấp thụ quan g A Lượng chất physcion m (µg) Đường tuyến tính physcion
32
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết physcion cho màu vàng nhạt, các vết gọn, rõ nét, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - physcion
STT Vch (µl) mđ (µg) A 1 50 49.00 0.353 2 50 49.00 0.331 3 50 49.00 0.348 4 50 49.00 0.341 5 50 49.00 0.353 6 50 49.00 0.321 TB 0.341 SD 0.012 RSD (%) 3.5 Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: Độ hấp thụ
Kết quả thu được RSD = 3.5% < 5.0%, cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của phép đo nhỏ, phương pháp phù hợp và có thể áp dụng để định lượng physcion.
33
34
3.4.1.2.Định lượng Emodin và Physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ
Áp dụng phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành sắc ký lớp mỏng như ở mục
2.3.4.4, đo quang ở bước sóng 250nm, để định lượng, đánh giá hàm lượng emodin và
physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ sống và sau chế biến. Kết quả được trình bày ở
Hình 3.11, Bảng 3.4 và Bảng 3.5.
Bảng 3.6. Kết quả định lượng Emodin trong các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến Mẫu S AG AC B C C₀ (µg/µl) 1000 1000 1000 1000 1000 Vch (µl) 30 30 30 30 30 mđ (µg) 30000 30000 30000 30000 30000 A 0.181 0.261 0.336 0.376 0.324 mEm (µg) 21.34 34.90 47.61 54.39 45.58 HLEm (%) 0.07 0.12 0.16 0.18 0.15
Chú thích: Cₒ: nồng độ tương ứng với lượng DL ban đầu trong mẫu (µg/µl)
Vch: thể tích chấm (µl)
mđ: lượng dược liệu đem đo quang tương ứng mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: độ hấp thụ quang
mEm: lượng emodin trong mẫu đo quang mEm=𝐴−0.0551
0.0059 (µg) HLEm: hàm lượng emodin trong mẫu HLEm= (mEm/mđ)*100 (%)
Độ hấp thụ và lượng emodin tính được ở các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính, đảm bảo áp dụng được phương pháp đã xây dựng. Hàm lượng emodin trong các mẫu chế biến đều cao hơn hẳn so với dược liệu sống. Đối với phương pháp chế theo DĐVN (A), hàm lượng emodin mẫu xử lý qua nước vo gạo (AG) cao hơn mẫu mẫu dược liệu sống (S) và tiếp tục tăng sau khi chế biến hoàn thiện (AC). Giữa các mẫu chế theo DĐVN (AC), mẫu chỉ chế với đậu đen (B) và mẫu chế rượu (C) hàm lượng emodin có sự chênh lệch, mẫu B có hàm lượng emodin cao nhất, tuy nhiên không quá khác biệt.
35
Bảng 3.7. Kết quả định lượng Physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến Mẫu S AG AC B C C₀ (µg/µl) 1000 1000 1000 1000 1000 Vch (µl) 30 30 30 30 30 mđ (µg) 30000 30000 30000 30000 30000 A 0.384 0.501 0.462 0.388 0.39 mPh (µg) 48.86 80.49 69.95 49.95 50.49 HLPh (%) 0.16 0.27 0.24 0.17 0.17
Chú thích: Cₒ: nồng độ tương ứng với lượng DL ban đầu trong mẫu (µg/µl) Vch: thể tích chấm (µl)
mđ: lượng dược liệu đem đo quang tương ứng mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: độ hấp thụ quang
CPh: nồng độ physcion trong mẫu đo quang CPh=𝐴−0.2032
0.0037 (µg/ml) HLPh: hàm lượng physcion trong mẫu HLPh= (CPh/Cđ)*100 (%)
Độ hấp thụ và nồng độ physcion tính được ở các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính, đảm bảo áp dụng được phương pháp đã xây dựng. Kết quả cho thấy hàm lượng physcion ở mẫu chế theo DĐVN (A) tăng cao hơn đáng kể so với dược liệu sống, hàm lượng physcion mẫu chỉ chế với đậu đen (B) và mẫu chế rượu (C) không khác nhau, đều thấp hơn mẫu A, tăng không đáng kể so với dược liệu sống.
Nhìn chung, anthraquinon tự do tăng trong quá trình chế biến, ở mẫu chế theo phương pháp A có sự biến đổi rõ ràng nhất đối với cả 2 chất emodin và physcion, đây