3.4.1.1.Xây dựng phương pháp
a) Khảo sát khoảng tuyến tính của emodin:
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như đã trình bày ở mục 2.3.4.2 đối với dung dịch chất đối chiếu emodin nồng độ C₀ 3.93µg/µl. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở
Hình 3.5.
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết emodin cho màu vàng đậm, các vết gọn, rõ nét, không có vết lạ, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính emodin
STT 1 2 3 4 5
Vch (µl) 15 25 50 75 100
mđ (µg) 19.65 32.75 65.50 98.25 131.00
A 0.171 0.259 0.414 0.647 0.823
Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ=𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
3 (µg)
26
27
Từ kết quả trên xây dựng được đường tuyến tính (Hình 3.6) với: Phương trình đường tuyến tính: Y = 0.0059*X + 0.0551
Trong đó: Y: độ hấp thụ quang X: lượng chất emodin
Hình 3.6. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo lượng chất emodin
Phương trình đường tuyến tính của emodin có hệ số tương quan R = 0.998 đảm bảo thực hiện phép định lượng với nồng độ emodin trong khoảng tuyến tính 19.65 – 131.00 (µg/ml).
b)Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - emodin
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.4.3 đối với dung dịch chất đối chiếu emodin nồng độ C₀ 3.93 µg/µl. Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.7.
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết emodin cho màu vàng đậm, các vết gọn, rõ nét, không có vết lạ, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.3. y = 0,0059x + 0,0551 R² = 0,9965 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 Độ hấp thụ quang A Lượng chất emodin m (µg) Đường tuyến tính emodin
28
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - emodin
STT Vch (µl) mđ (µg) A 1 50 65.50 0.435 2 50 65.50 0.449 3 50 65.50 0.483 4 50 65.50 0.448 5 50 65.50 0.453 6 50 65.50 0.464 TB 0.455 SD 0.015 RSD (%) 3.3 Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ=𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
3 (µg)
A: Độ hấp thụ quang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thu được RSD = 3.3% < 5.0%, cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của phép đo nhỏ, phương pháp phù hợp và có thể áp dụng để định lượng emodin.
29
30 c) Khảo sát khoảng tuyến tính của physcion
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.4.2 đối với dung dịch chất đối chiếu physcion nồng độ C₀ 0.98 (µg/µl). Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở Hình 3.8.
31
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366 nm các vết physcion cho màu vàng nhạt, các vết gọn, rõ nét, Rf tương đương nhau, có một vài vết lạ nhưng các vết rất nhạt tách hoàn toàn với vết physicon.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250 nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.4:
Bảng 3.4. Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính physcion
STT 1 2 3 4 5
Vch (µl) 15 25 50 75 100
mđ (µg) 14.70 24.50 49.00 73.50 98.00
A 0.230 0.339 0.353 0.484 0.560
Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: Độ hấp thụ quang
Từ kết quả trên xây dựng được phương trình đường tuyến tính Y = 0.0037*X + 0.2032 (Hình 3.9) với hệ số tương quan R = 0.970 (trong đó Y: độ hấp thụ quang, X: nồng độ physcion). Có thể thực hiện phép định lượng physcion với nồng độ physcion trong khoảng 14.70 - 98.00 (µg/ml).
Hình 3.9. Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo lượng chất physcion
d)Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - physcion
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như đã trình bày ở mục 2.3.4.3 đối với dung dịch chất đối chiếu physcion nồng độ C₀ 0.98µg/µl thu được kết quả như Hình 3.10
y = 0,0037x + 0,2032 R² = 0,9424 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Độ h ấp thụ quan g A Lượng chất physcion m (µg) Đường tuyến tính physcion
32
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết physcion cho màu vàng nhạt, các vết gọn, rõ nét, Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - physcion
STT Vch (µl) mđ (µg) A 1 50 49.00 0.353 2 50 49.00 0.331 3 50 49.00 0.348 4 50 49.00 0.341 5 50 49.00 0.353 6 50 49.00 0.321 TB 0.341 SD 0.012 RSD (%) 3.5 Chú thích: Vch: Thể tích chấm (µl)
mđ: Lượng chất đem đo quang, mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: Độ hấp thụ
Kết quả thu được RSD = 3.5% < 5.0%, cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD của phép đo nhỏ, phương pháp phù hợp và có thể áp dụng để định lượng physcion.
33
34
3.4.1.2.Định lượng Emodin và Physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Áp dụng phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành sắc ký lớp mỏng như ở mục
2.3.4.4, đo quang ở bước sóng 250nm, để định lượng, đánh giá hàm lượng emodin và
physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ sống và sau chế biến. Kết quả được trình bày ở
Hình 3.11, Bảng 3.4 và Bảng 3.5.
Bảng 3.6. Kết quả định lượng Emodin trong các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến Mẫu S AG AC B C C₀ (µg/µl) 1000 1000 1000 1000 1000 Vch (µl) 30 30 30 30 30 mđ (µg) 30000 30000 30000 30000 30000 A 0.181 0.261 0.336 0.376 0.324 mEm (µg) 21.34 34.90 47.61 54.39 45.58 HLEm (%) 0.07 0.12 0.16 0.18 0.15
Chú thích: Cₒ: nồng độ tương ứng với lượng DL ban đầu trong mẫu (µg/µl)
Vch: thể tích chấm (µl)
mđ: lượng dược liệu đem đo quang tương ứng mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: độ hấp thụ quang
mEm: lượng emodin trong mẫu đo quang mEm=𝐴−0.0551
0.0059 (µg) HLEm: hàm lượng emodin trong mẫu HLEm= (mEm/mđ)*100 (%)
Độ hấp thụ và lượng emodin tính được ở các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính, đảm bảo áp dụng được phương pháp đã xây dựng. Hàm lượng emodin trong các mẫu chế biến đều cao hơn hẳn so với dược liệu sống. Đối với phương pháp chế theo DĐVN (A), hàm lượng emodin mẫu xử lý qua nước vo gạo (AG) cao hơn mẫu mẫu dược liệu sống (S) và tiếp tục tăng sau khi chế biến hoàn thiện (AC). Giữa các mẫu chế theo DĐVN (AC), mẫu chỉ chế với đậu đen (B) và mẫu chế rượu (C) hàm lượng emodin có sự chênh lệch, mẫu B có hàm lượng emodin cao nhất, tuy nhiên không quá khác biệt.
35
Bảng 3.7. Kết quả định lượng Physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến Mẫu S AG AC B C C₀ (µg/µl) 1000 1000 1000 1000 1000 Vch (µl) 30 30 30 30 30 mđ (µg) 30000 30000 30000 30000 30000 A 0.384 0.501 0.462 0.388 0.39 mPh (µg) 48.86 80.49 69.95 49.95 50.49 HLPh (%) 0.16 0.27 0.24 0.17 0.17
Chú thích: Cₒ: nồng độ tương ứng với lượng DL ban đầu trong mẫu (µg/µl) Vch: thể tích chấm (µl)
mđ: lượng dược liệu đem đo quang tương ứng mđ= 𝐶₀ ∗ 𝑉𝑐ℎ (µg) A: độ hấp thụ quang
CPh: nồng độ physcion trong mẫu đo quang CPh=𝐴−0.2032
0.0037 (µg/ml) HLPh: hàm lượng physcion trong mẫu HLPh= (CPh/Cđ)*100 (%)
Độ hấp thụ và nồng độ physcion tính được ở các mẫu đều nằm trong khoảng tuyến tính, đảm bảo áp dụng được phương pháp đã xây dựng. Kết quả cho thấy hàm lượng physcion ở mẫu chế theo DĐVN (A) tăng cao hơn đáng kể so với dược liệu sống, hàm lượng physcion mẫu chỉ chế với đậu đen (B) và mẫu chế rượu (C) không khác nhau, đều thấp hơn mẫu A, tăng không đáng kể so với dược liệu sống.
Nhìn chung, anthraquinon tự do tăng trong quá trình chế biến, ở mẫu chế theo phương pháp A có sự biến đổi rõ ràng nhất đối với cả 2 chất emodin và physcion, đây cũng là mẫu cho thấy sự biến đổi của acid gallic. Tuy nhiên emodin và physcion là hai anthraquinon tự do không thể đại diện cho sự biến đổi của toàn bộ nhóm anthraquinon trong khi trong Hà thủ ô đỏ còn một lượng lớn anthraquinon kết hợp đặc biệt là dẫn chất glycosid của hai chất này và chúng có thể chuyển hóa lẫn nhau.
36
Hình 3.11. Sắc ký đồ định lượng emodin và physcion trong các mẫu Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến
37
Trên sắc kí đồ, hầu hết các mẫu đều tách rõ nét vết emodin và physcion, có hiện tượng kéo chân phía dưới nhưng không ảnh hưởng tới việc định lượng emodin và physcion vì 2 vết này đã tách hoàn toàn, tuy nhiên nếu dùng bản này để định lượng 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid thì kết quả có thể không chính xác. Mẫu chế theo DĐVN (AC) cho sắc kí đồ với các vết tách nhau tốt nhất trong khi mẫu chế rượu (C) có hiện tượng kéo vết rõ rệt nhất, điều này có thể gây ảnh hưởng đến phép phân tích khi thực tế hàm lượng physcion có thể cao hơn kết quả định lượng còn emodin thì thấp hơn.
Phương pháp TLC-UV thao tác đơn giản, dễ thực hiện nhưng phương pháp này gây khá nhiều sai số vì nó trải qua rất nhiều bước, đặc biệt là trong thao tác cạo vết bản mỏng, khả năng tách các chất trong sắc ký lớp mỏng cũng không ổn định do chịu tác động của nhiều yếu tố như lượng chất đưa lên bản mỏng, thể chất dịch chấm, thời gian khai triển,…. Cụ thể với emodin, đường tuyến tính xây dựng được có hệ số tương quan cao trong khi với physcion thì hệ số này lại hơi thấp, cùng điều kiện sắc kí nhưng khả năng tách các chất ở các mẫu lại khác nhau.