2.2.1.Tổng hợp hóa học
Chúng tôi tiến hành tổng hợp 3 dẫn chất acyl hóa của genistein với hai tác nhân anhydrid acetic và bezoyl clorid theo Sơ đồ 2.1:
17
Sơ đồ 2.1. Hướng tổng hợp các dẫn chất acyl hóa của genisein
Công thức và tên các chất dự kiến tổng hợp được trình bày trong.
Bảng 2.3. Tên và công thức chất tổng hợp.
Chất Công thức cấu tạo Tên khoa học
II 3-(4-acetoxyphenyl)-4- oxo-4H-chromen-5,7- diyl diacetat IIIa 5-hydroxy-3-(4- hydroxyphenyl)-4-oxo- 4H-chromen-7-yl benzoat IIIb 4-(7-(benzoyloxy)-5- hydroxy-4-oxo-4H- chromen-3-yl)phenyl benzoat
18
2.2.2.Kiểm tra độ tinh khiết khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được
• Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định Rf mỗi sản phẩm.
• Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp được.
2.2.3.Thử tác dụng sinh học
Thử hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào MCF-7 (là tế bào ung thư vú ở người) của nguyên liệu genistein (I) và các dẫn chất tổng hợp được (II, IIIa, IIIb).
2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.3.1.Phản ứng acyl hóa 2.3.1.Phản ứng acyl hóa
• Acyl hóa genistein với các tác nhân anhydrid acetic, benzoyl clorid.
• Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi khai triển khác nhau n-hexan : EtOAc (1,5 : 2), n-hexan : EtOAc (3 : 2). Quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại.
• Sử dụng các phương pháp lọc, kết tinh lại để tinh chế sản phẩm.
2.3.2.Kiểm tra độ tinh khiết
• Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel 60 F254 với hệ dung môi thích hợp như đã nêu ở 2.3.1., quan sát dưới đèn tử
ngoại ở bước sóng 254 nm.
• Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt, dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm.
2.3.3.Xác định cấu trúc
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon-13 (13C-NMR):
• Phổ khối lượng (MS): Được ghi tại phòng thí nghiệm Vật liệu hóa học, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy LTQ Orbitrap XLTM (Mỹ); tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy 920-MS TQ-FT của hãng Agilent Technologies.
19
• Phổ hồng ngoại (IR): Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong vùng 4000-400 cm-1 và được ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1 : 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon-13 (13C-NMR): Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Hóa Học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy Bruker 500 MHz Ascend, chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS).
2.3.4.Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cả chất: I, II, IIIa, IIIb thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
- Dòng tế bào thử nghiệm: dòng tế bào MCF-7 dòng tế bào ung thư vú ở người, ở chuột và tế bào lành. Các dòng tế bào do GS. TS. J. M. Pezzuto, trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. - Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt), có bổ sung thêm L-glutamin, natri pyruvat, NaHCO3, penicillin/streptomycin, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), trypsin-EDTA (0.05%).
- Dụng cụ, thiết bị cơ bản: kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL); buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ) ; máy quang phổ (BioTek) ; tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu -80oC, bình nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH và các dụng cụ thí nghiệm thông thường. - Các hóa chất cơ bản khác: DMSO (dimethyl sulfoxid), TCA (acid tricloroacetic),
tris base, PBS (phosphate buffered saline), Ellipticine, SRB (sulforhodamin B), acetic acid.
- Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở
20
điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan và cộng sự (1990). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
+ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
+ Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng tricloracetic acid – TCA 20%.
+ Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
+ Dùng 10 mM tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).
+ Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% − 𝑂𝐷(𝑚ẫ𝑢) − 𝑂𝐷(𝑛𝑔à𝑦0) 𝑂𝐷(𝐷𝑀𝑆𝑂) − 𝑂𝐷(𝑛𝑔à𝑦0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticin ở các nồng độ 10
g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng tham khảo.
- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 5 μM [21].
21
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Thực nghiệm và kết quả
3.1.1.Tổng hợp 3-(4-acetoxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-5,7-diyl diacetat với tác
nhân anhydrid acetic
➢ Sơ đồ phản ứng:
Sơ đồ 3.1. Phản ứng tổng hợp II
➢ Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 0,50 g genistein (1,85 mmol) vào 10 mL pyridin trong bình cầu 2 cổ 100 mL, khuấy trong 10 phút ở điều kiện trơ, nhiệt độ phòng. Sau đó, nhỏ từ từ 3,7 mL anhydrid acetic (Ac2O) (0,039 mmol) vào bình phản ứng, duy trì khuấy ở nhiệt độ 0- 10°C trong 2h. Sau đó nâng nhiệt độ khối phản ứng đến 60-70°C và duy trì khuấy trong 2h. Theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi là n-hexan : EtOAc (1,5 : 2).
➢ Xử lý phản ứng:
Loại tác nhân anhydrid acetic và dung môi pyridin: pha dung dịch HCl 0,5M. Nhỏ từ từ dung dịch HCl 0,5M vào bình phản ứng đồng thời khuấy, đến pH 1-2. Sau đó, lọc rửa tủa 3 lần với nước cất.
Kết tinh lại thu sản phẩm: tủa được hòa tan trong 10 mL ethanol nóng, làm lạnh để kết tinh qua đêm, lọc rửa tủa, sấy tủa bằng đèn hồng ngoại 100W đến khối lượng không đổi.
➢ Kết quả:
✓ m = 0,64 g.
✓ Cảm quan: chất rắn kết tinh màu trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
✓ Hiệu suất: 87,3%.
✓ Nhiệt độ nóng chảy: 206-207,6°C.
22
✓ Nhận xét: Trên SKLM sản phẩm cho một vết gọn hình elip với giá trị Rf như
trên và không có vết lạ. Như vậy có thể sơ bộ kết luận sản phẩm thu được tinh khiết về mặt hóa học, có thể tiến hành đo phổ để khẳng định chính xác cấu trúc của sản phẩm.
➢ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol genistein : Ac2O đến khả năng gắn nhóm thế:
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng về tỷ lệ mol genistein : Ac2O
STT Tỷ lệ mol genistein : Ac2O Sắc ký lớp mỏng theo dõi phản ứng Cảm quan sản phẩm 1 1 : 5 Vẫn còn vết nguyên liệu, 3 vết sản phẩm acyl hóa Bột kết tinh màu trắng vàng 2 1 : 10 Còn vết nguyên liệu mờ, 2 vết trong đó vết sản phẩm chính nhạt Bột kết tinh màu trắng ngà 3 1 : 15
Không còn vết nguyên liệu, 2 vết trong đó vết sản phẩm
chính đậm, vết tạp nhạt
Bột kết tinh màu trắng ngà Hiệu suất: 60,5%
4 1 : 21
Không còn vết nguyên liệu, một vết sản phẩm chính
đậm, dự đoán là II
Bột kết tinh màu trắng mịn Hiệu suất: 87,3%
5 1:25
Không còn vết nguyên liệu, một vết sản phẩm chính
đậm, dự đoán là II
Bột kết tinh màu trắng mịn Hiệu suất: 87,1%
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ mol genistein : Ac2O thì khả năng acyl hóa vào cả ba
vị trí OH phenol tăng lên. Mặc dù ở tỷ lệ 1 : 15 trở lên vết nguyên liệu đã hết nhưng lượng tạp chất do sản phẩm acyl hóa nhiều vị trí vẫn còn sẽ làm giảm hiệu suất tinh chế sản phẩm, đồng thời mất thời gian và khó khăn trong việc tách loại hoàn toàn sản phẩm phụ. Còn khi tỷ lệ mol là 1 : 25, thu được một vết sản phẩm nhưng hiệu suất cũng không tăng thêm. Từ đó chúng tôi tiến hành phản ứng với tỷ lệ mol giữa genistein : Ac2O = 1 : 21.
23
3.1.2.Phản ứng acyl hóa genistein với tác nhân benzoyl clorid:
3.1.2.1. Tổng hợp 5-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-7-yl
benzoat
➢ Sơ đồ phản ứng:
Sơ đồ 3.2. Phản ứng tổng hợp IIIa
➢ Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 0,50 g genistein (1,85 mmol) với 50 mL THF khan (làm khan bằng Na2SO4 khan) trong bình cầu hai cổ dung tích 200 mL, thêm 0,3 mL Et3N (2,15 mmol), khuấy ở nhiệt độ 0-10°C khoảng 15 phút. Sau đó nhỏ từ từ 0,24 mL benzoyl clorid (2,07 mmol) hòa tan trong 10 mL THF khan đựng trong bình nhỏ giọt vào bình cầu, duy trì khuấy ở 0-10°C trong 1h. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 60-70°C, duy trì khuấy trong 3h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2).
Sau 3h thấy hết nguyên liệu thì dừng phản ứng. Trên SKLM cho 2 vết, dự đoán là IIIa và IIIb với tỉ lệ 8:2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
➢ Xử lý phản ứng:
Tiến hành lọc rửa tủa bằng nước cất 3 lần, sấy dưới đèn hồng ngoại thu hỗn hợp chất rắn màu trắng ngả vàng.
Loại sản phẩm phụ IIIb: khuấy hỗn hợp chất rắn trong 150 mL IPA nóng ở
nhiệt độ 60-70°C trong 40 phút. Lọc loại bỏ tủa không tan trong IPA, thu lấy dịch trong. Dịch trong được cô quay chân không ở nhiệt độ 60-65°C để loại bớt IPA. Cô đến khi trong bình cầu thấy xuất hiện tủa trở lại thì dừng.
Kết tinh, thu sản phẩm: làm lạnh để kết tinh trong 1 ngày. Lọc lấy tủa, sấy tủa bằng đèn hồng ngoại 100W.
➢ Kết quả:
✓ m = 0,49g.
✓ Cảm quan: chất rắn kết tinh màu trắng.
✓ Hiệu suất: 70,8%
24
✓ Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ thấy 1 vết rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf =0,53 (hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2))
➢ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid đến hiệu suất phản ứng
Trong quá trình khảo sát chúng tôi giữ nguyên các điều kiện phản ứng, quy trình tiến hành, chỉ thay đổi tỷ lệ mol các chất cần khảo sát.
Bảng 3.2. Khảo sát tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid từ 1 : 1 đến 1 : 1,3
STT
Tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid
SKLM theo dõi phản ứng Hiệu suất (%)
1 1 : 1
Có 3 vết, còn vết nguyên liệu mờ, vết sản phẩm IIIa
đậm hơn IIIb với tỷ lệ 9:1
65,9
2 1 : 1,1
Có 2 vết, không còn vết nguyên liệu, vết IIIa đậm
hơn IIIb với tỷ lệ 8:2
70,8
3 1 : 1,3
Có 2 vết, không còn vết nguyên liệu, vết IIIb đậm
hơn, tỷ lệ IIIa và IIIb dự đoán 6:4
53,9
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid làm tăng khả năng tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sản phẩm phụ IIIb, gây khó khăn trong việc tách sản phẩm chính IIIa và làm giảm
đáng kể hiệu suất. Tuy nhiên ở tỷ lệ 1 : 1 do vẫn còn nguyên liệu chưa phản ứng hết nên làm giảm hiệu suất tạo sản phẩm IIIa. Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy phản ứng với tỷ lệ 1 : 1,1 cho hiệu suất cao nhất (H=70,8%).
3.1.2.2. Tổng hợp 4-(7-(benzoyloxy)-5-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-3-yl)phenyl
benzoat
25
Sơ đồ 3.3. Phản ứng tổng hợp IIIb
➢ Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 0,50 g genistien (1,85 mmol) trong 250 mL THF trong bình cầu hai cổ dung tích 500 mL, thêm 1,5 mL Et3N (10,75 mmol), khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Pha loãng 1,1 mL benzoyl clorid (9,47 mmol) với 10 mL THF trong bình nhỏ giọt khô. Tiến hành nhỏ từ từ tác nhân vào bình phản ứng trong 1h, duy trì khuấy ở nhiệt độ 0-10°C, sau đó nâng nhiệt độ lên 60-70°C, duy trì khuấy trong 3h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2).
Sau 3h phản ứng kết thúc. Trên SKLM cho một vết, không còn vết nguyên liệu, dự đoán là IIIb.
➢ Xử lý phản ứng:
Lọc lấy tủa, rửa với IPA 1 lần, sau đó rửa tiếp với nước cất 2 lần. Khuấy tủa thu được với 10 mL cồn 96o, lọc lấy phần không tan và sấy sản phẩm ở nhiệt độ 40-45°C.
➢ Kết quả:
✓ m= 0,65g.
✓ Cảm quan: bột màu trắng.
✓ Hiệu suất: 73,4%
✓ Nhiệt độ nóng chảy: 209,4 – 212,6°C
✓ Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2) thấy 1 vết rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf =0,70.
➢ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid đến hiệu suất phản ứng Quá trình khảo sát chúng tôi giữ nguyên các điều kiện phản ứng, chỉ thay đổi tỷ lệ mol các chất cần khảo sát.
Bảng 3.3. Khảo sát tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid 1 : 3 đến 1 : 5,5
STT Tỷ lệ genisteien : bezoyl clorid SKLM theo dõi phản ứng Rf (hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2)) Hiệu suất (%)
26 1 1 : 3 2 vết, vết IIIa và IIIb đều đậm IIIa: 0,53 IIIb: 0,70 56,4 2 1: 4,5 2 vết, IIIb đậm, IIIa nhạt 70,1 3 1 : 5 1 vết IIIb IIIb: 0,70 73,4 4 1 : 5,5 1 vết IIIb IIIb: 0,70 72,6
Nhận xét: Khi tăng tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid làm tăng khả năng tạo
sản phẩm IIIb. Tuy nhiên ở tỷ lệ 1 : 5,5 hiệu suất phản ứng không tăng lên, chúng tôi tiến hành phản ứng với tỷ lệ 1 : 5 cho hiệu suất cao nhất (H=73,4%).
3.2.Xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ
Để xác định cấu trúc của sản phẩm, chúng tôi đã tiến hành ghi và phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR). Kết quả phổ được trình bày cụ thể như sau:
3.2.1.Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất.
CTCT Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trưng νmax (cm-1) Phụ lục (II) C-H thơm 3084, 3041 1 C=O ester 1779, 1744 C=O (1,4- benzopyron) 1646 C=C thơm 1626, 1569, 1509 C-O 1250, 1199, 1178, 1123, 1043 O-H phenol 3512 2
27 (IIIa) C-H thơm 3075 C=O ester 1732 C=O (1,4- benzopyron) 1654 C=C thơm 1614, 1581, 1517, 1481 C-O 1272, 1249, 1196, 1170, 1136, 1104 (IIIb) O-H phenol 3423 3 C-H thơm 3070 C=O ester 1738, 1720 C=O (1,4- benzopyron) 1651 C=C thơm 1620, 1583, 1510, 1485 C-O
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});