Bảng 3.9. Kết quả phổ 13C-NMR của II.
Công thức cấu tạo
Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon: 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm):
Phụ lục
31 174,29 (C-4); 169,45 (C-13); 169,40 (C-11); 167,95 (C-9); 157,77 (C-8a); 153,91 (C-7); 152,07 (C-2); 150,83 (C-5); 150,71 (C-4’); 130,30 (C-2’, C-6’); 128,83 (C-1’); 125,75 (C-3); 121,77 (C-3’, C-5’); 115,62 (C-4a); 113,98 (C-6); 109,06 (C-8); 21,17 (C-14); 21,14 (C-10, C-12) 10
Bảng 3.10. Kết quả phổ 13C-NMR của IIIa.
Công thức cấu tạo
Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon: 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): Phụ lục 180,95 (C-4); 163,73 (C-9); 161,35 (C-5); 157,60 (C-7); 156,40 (C-8a); 155,89 (C-4’); 155,16 (C-2); 134,31 (C-4”); 130,18 (C-2’, C-6’); 129,95 (C-2”, C-6”); 128,98 (C-3”, C-5”); 128,39 (C-1”); 122,97 (C-1’); 120,74 (C-3); 115,11 (C-3’, C-5’); 108,88 (C-4a); 105,38 (C-6); 101,50 (C-8) 11
32
Bảng 3.11. Kết quả phổ 13C-NMR của IIIb.
Công thức cấu tạo
Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon: 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): Phụ lục 180,33 (C-4); 164,20 (C-10); 163,40 (C-9); 161,13 (C-5); 156,25 (C-7); 155,84 (C-8a); 155,73 (C-2); 150,43 (C-4’); 133,91 (C-4”); 133,61 (C-4”’); 129,87 (C-2”, C-6”); 129,60 (C-2”’, C-6”’); 129,42 (C-2’, C-6’); 128,74 (C-1’); 128,62 (C-3”, C-5”); 128,57 (C-3”’, C-5”’); 128,25 (C-1”); 127,88 (C-1”’); 122,13 (C-3); 121,37 (C-3’, C-5’); 108,71 (C-4a); 105,15 (C-6); 101,11 (C-8) 12 Chú thích: δ: độ dịch chuyển hoá học (ppm)
Nhận xét: Dựa trên kết quả Bảng 3.9-3.11 và phổ đồ (Phụ lục 10-12), phổ 13C-
NMR của các hợp chất cho tín hiệu số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các carbon là phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến.
3.3. Thử tác dụng sinh học
33
Bảng 3.12. Tỷ lệ phần trăm ức chế tế bào ung thư MCF-7 của các chất.
Nồng độ (µg/mL)
% ức chế tế bào MCF-7
II IIIa IIIb Genistein Ellipticin % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế % ức chế 50 52.91 72.72 18.27 78.18 97.26 10 13.14 11.15 9.95 20.51 85.78 2 9.71 3.97 7.62 3.19 51.36 0.4 6.07 2.70 4.96 0.64 24.92 IC50 (µg/mL) 47.42±1.74 37.09±1.76 >50 29.16±2.88 0.35±0.04 IC50 (µM) 119,64±4,39 99,08±4,70 >104,50 107,90±10,67 1,42±0,16
Ghi chú: Ellipticin thử nghiệm ở dải nồng độ 10-2-0.4-0.08 µg/mL
3.3.Bàn luận
3.3.1.Về bán tổng hợp hóa học 3.3.1.1. Về tổng hợp dẫn chất II
❖ Cơ chế phản ứng:
Phản ứng xảy ra theo cơ chế ái điện tử (SE) theo Sơ đồ 3.4 [3]:
Sơ đồ 3.4. Cơ chế phản ứng của genistein với Ac2O
Giai đoạn đầu: pyridin có nguyên tử nitơ còn cặp electron sẽ tấn công vào vị trí C ceton tạo phức hợp pyridin. Giai đoạn này cần làm lạnh để làm bền và tăng số lượng phức.
Giai đoạn sau: nguyên tử C của nhóm acyl dương điện là tác nhân ái điện tử nên dễ dàng phản ứng với OH phenol nhờ nguyên tử oxy mang cặp electron.
❖ Tiến hành phản ứng:
Cấu trúc của genistein cho thấy có 3 nhóm OH phenol tại các vị trí C-4’, C-5, C-7. Qua thực nghiệm, phản ứng acetyl hóa genistein với tác nhân anhydrid acetic là tương đối khó chọn lọc (quan sát trên bản mỏng ngoài vết nguyên liệu, còn có các sản phẩm khác là dẫn chất mono, di và triacetyl genistein).
34
Hình 3.1. Hệ số lưu giữ Rf các dẫn chất acetyl trên bản mỏng với hệ n-hexan : EtOAc (1,5 : 2)
Chính vì vậy, để khống chế thu được sản phẩm chọn lọc thì cần kiểm soát điều kiện phản ứng, đặc biệt là tỷ lệ mol. Ngay cả khi thử nghiệm ở tỷ lệ mol 1 : 1 cũng có thể tạo ra sản phẩm di, ở tỷ lệ 1 : 2 cũng có thể tạo ra tạp tri. Trong khuôn khổ thời gian khóa luận có hạn, chúng tôi tìm điều kiện để tạo ra dẫn chất triacetyl mà theo đó là dễ tiến hành nhất. Chính vì vậy, chúng tôi sử dụng tỷ lệ mol dư (1 : 21). Và thực tế dẫn chất triacetyl đã được tác giả Yue-qing Li và cộng sự công bố với tỷ lệ mol sử dụng trong tài liệu là 1 : 21 và đạt hiệu suất 98% [33]. Chúng tôi triển khai dựa trên các thông số như thế và cũng thu được sản phẩm là triacetyl với hiệu suất là 87,3%.
Ở đây, nhằm giảm lượng tác nhân Ac2O, chúng tôi tiến hành khảo sát thêm một số tỷ lệ mol khác. Thực tế cho thấy, khi giảm lượng tác nhân đi lại không thu được kết quả là triacetyl, mà lúc đó thường xuất hiện các tạp mono và diacetyl hóa. Nhằm nâng cao hiệu suất, tiếp tục tăng tỷ lệ mol lên 1 : 25 nhưng hiệu suất không tăng thêm. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ 1 : 21 cho hiệu suất tối ưu nhất. Qua đó cho thấy, tác nhân Ac2O rất kém bền, có thể phản ứng ngay với hơi nước ở trong không khí tạo acid acetic gây hỏng tác nhân [3], tác nhân để lâu có thể nhiễm nước cũng là một nguyên nhân của việc phản ứng không đạt hiệu quả. Để hạn chế ảnh hưởng của hơi nước nên trong quá trình đặt phản ứng, khí trơ được sục và sử dụng ống làm khan.
Về yếu tố nhiệt độ của phản ứng: khi theo dõi biến thiên nhiệt độ phản ứng, chúng tôi nhận thấy phản ứng xảy ra giống như nhiều phản ứng acyl hóa khác: giai đoạn đầu cung cấp nhiệt, giai đoạn giữa hạ nhiệt để loại bớt nhiệt, giai đoạn cuối cung cấp nhiệt [3].
35
- Giai đoạn giữa khi cho tác nhân vào, phản ứng xảy ra mãnh liệt, hạ nhiệt độ xuống 0-10°C để bền hạt acyli trung gian.
- Giai đoạn sau phản ứng chúng tôi chỉ nâng lên đến 60-70°C để hạn chế oxy hóa genistein.
Ngoài ra trong quy trình, khí N2 được sử dụng cũng nhằm hạn chế sự có mặt của O2.
❖ Xử lí phản ứng:
Ở tỷ lệ mol 1 : 21, tạp của khối phản ứng là anhydrid acetic dư, acid acetic, pyridin; không có tạp nguyên liệu, tạp mono và diacetyl. Chúng tôi sử dụng HCl loãng pH 1-2 đủ để tạo muối với pyridin (nếu pH lớn hơn thì pyridin là base yếu sẽ không tạo muối triệt để, còn nếu pH < 1 thì lượng acid cho vào nhiều có thể gây phân hủy các liên kết ester). Ngoài ra nước trong acid loãng cũng giúp phân hủy tác nhân dư thành acid acetic. Cả tạp anhydrid acetic và acid acetic, muối pyridin đều tan trong nước, trong khi đó sản phẩm thu được tủa trong nước, nên các tạp đã bị loại đi khi lọc và rửa với nước cất. Để thu được sản phẩm tinh khiết hơn, chúng tôi đã tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh trong EtOH.
Trong suốt quá trình phản ứng, chúng tôi theo dõi bằng SKLM với hệ n-hexan : EtOAc (1,5 : 2), sản phẩm cho một vết đậm với Rf=0,81 , dự đoán là II.
Phương pháp này có ưu điểm điều kiện phản ứng đơn giản, dễ tiến hành, sản phẩm dễ tinh chế, hiệu suất tương đối cao (H=87,3%). Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp là tiêu tốn lượng lớn tác nhân (dư so với thực tế 7 lần)
Phản ứng được thực hiện dựa theo phương pháp của Yue-qing Li, tuy nhiên hiệu suất thu được thấp hơn (thấp hơn 10,7%). Nguyên nhân có thể do trong quá trình làm lạnh nhiệt độ chưa đủ làm bền và tạo ra tối đa lượng phức pyridin.
3.3.1.2. Về tổng hợp IIIa và IIIb
❖ Cơ chế phản ứng chung:
Phản ứng xảy ra theo cơ chế ái điện tử (SE) theo Sơ đồ 3.5:
PhCOCl dễ dàng phân ly thành cation acyli và giải phóng Cl-, cation acyli này là tác nhân ái điện tử [3].
36
Sơ đồ 3.5. Cơ chế phản ứng của genistein với benzoyl clorid
❖ Quy trình phản ứng:
Phản ứng benzoyl hóa genistein chưa có tài liệu nào công bố trước đây. Thực nghiệm chỉ ra rằng sử dụng tác nhân benzoyl clorid cũng xảy ra không chọn lọc trên các OH phenol của genistein. Tuy nhiên, so với phản ứng acetyl hóa, trên SKLM chỉ xuất hiện vết nguyên liệu và 2 vết sản phẩm (Hình 3.2).
Hình 3.2. Hệ số lưu giữ Rf của các dẫn chất benzoyl trên bản mỏng với hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2)
Việc cũng tiến hành đánh giá tỷ lệ mol genistein : benzoyl clorid từ 1 : 1 đến 1 : 5,5 để thu được sản phẩm chọn lọc là cần thiết (Bảng 3.2, Bảng 3.3). Mặc dù ở tỷ lệ mol 1 : 1, trên SKLM vẫn thu được hai vết cho rằng là monobenzoyl (IIIa) và dibenzoyl (IIIb). Nhưng ở tỷ lệ mol 1 : 1,1 không còn nguyên liệu, hầu như chỉ có dẫn chất mono hình thành, có một phần tạp dibenzoyl với tỷ lệ 2 chất khoảng 8 : 2. Và ở tỷ lệ mol 1 : 5 tối ưu thu được duy nhất một vết là dibenzoyl (IIIb) có Rf=0,70 cao hơn vết monobenzoyl (IIIa) Rf=0,53 (với hệ dung môi n-hexan : EtOAc (3 : 2)).
Ngoài ra chọn được điều kiện phản ứng là THF và Et3N, tham khảo dựa trên phản ứng acyl hóa genistein với các clorid khác [34].
37
Để tinh chế hỗn hợp phản ứng, chúng tôi đã dùng các kỹ thuật sau:
- Kết tủa để loại các tạp tan trong nước: THF, muối triethylamin hydroclorid và một phần acid benzoic.
- Tủa thu được vẫn còn khoảng 20% tạp IIIb theo SKLM. Chính vì vậy việc khảo
sát dung môi tinh chế là cần thiết, cụ thể như sau:
+ Aceton: hòa tan chậm, chấm sắc ký phần dịch thu được 2 vết trên bản mỏng với tỷ lệ không thay đổi.
+ Ethyl acetat: hòa tan kém, chấm sắc ký phần dịch thu được 2 vết trên bản mỏng với tỷ lệ không thay đổi.
+ n-hexan: hòa tan kém, lọc lấy tủa, hòa tan trong aceton, chấm sắc ký cho 2 vết, vết IIIb nhạt hơn nhưng không đáng kể.
+ IPA nóng: khuấy hỗn hợp phản ứng trong IPA nóng, sau khi lọc bỏ tủa, dịch thu được cho 1 vết IIIa đậm trên SKLM. Tủa không tan trong IPA nóng cho 1 vết IIIb trên SKLM.
Qua đó cho thấy IPA nóng hòa tan chọn lọc IIIa, không hòa tan IIIb so với dung môi còn lại nên IPA là dung môi được lựa chọn tinh chế sản phẩm. Sau khi tinh chế, thu được sản phẩm hiện một vết trên SKLM với Rf=0,53 (hệ n-hexan : EtOAc (3 : 2))
❖ Xử lý phản ứng tạo sản phẩm IIIb:
Với tỷ lệ mol 1 : 5 tiến hành phản ứng và thu được một vết IIIb trên SKLM.
Do tạo sản phẩm IIIb có cấu trúc cồng kềnh, lượng tủa sinh ra nhiều và bông xốp,
khiến cản trở sự khuấy trộn trong bình phản ứng, dẫn đến khả năng tương tác giữa genistein với tác nhân bị hạn chế. Chính vì vậy, chúng tôi sử dụng lượng lớn dung môi để pha loãng dịch phản ứng.
Sản phẩm IIIb như khảo sát phía trên, rất kém tan trong IPA. Do đó, lọc tủa lần 1, chúng tôi rửa tủa bằng IPA để loại tạp tan trong IPA (bao gồm IIIa và nguyên liệu). Sau đó lọc rửa tủa lần 2 với nước 2 lần để loại THF và Et3N. Cần chú ý rửa kỹ tủa ở trường hợp này bằng các dung môi do lượng dư đáng kể acid benzoic.
38
3.3.2.Về kết quả phân tích phổ 3.3.2.1. Phổ và cấu trúc của II
• Phổ hồng ngoại (IR): xuất hiện các dải hấp thụ với các đỉnh đặc trưng cho từng nhóm chức theo Bảng 3.5 II không có pic đặc trưng cho nhóm chức O-H phenol (pic đặc trưng của O-H phenol từ 3000-3600) đồng thời xuất hiện các pic đặc trưng của C=O ester (1779, 1744) nên có thể kết luận 3 nhóm O-H phenol của II đã bị acyl hóa hết.
• Phổ khối lượng (MS): xuất hiện pic ion [M+H]+ = 396,8. Pic này phù hợp với khối lượng phân tử của chất II (M = 396,35) và tương ứng với m/z lý thuyết đã tra được (m/z lý thuyết = 397,1), cụ thể ở Bảng 3.6. Qua đó có thể sơ bộ đánh giá sự có
mặt của chất dự kiến.
Trên SKLM chỉ có một vết sản phẩm, tuy nhiên trên phổ MS còn quan sát thấy pic của tạp diacetyl (M = 354,31) thể hiện ở [M+H]+ = 354,8 và [M-H]- = 352,8. Điều đó có thể do hạt ion phân tử [M+H]+ của nó bền hơn so với hạt phân tử của II.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz, CDCl3): Trên phổ 1H- NMR có các tín hiệu đặc trưng cho các proton trong phân tử trong đó tín hiệu doublet ở 7,42 ppm thuộc về 2 nguyên tử H-2’ và H-6’ do sự tương tác với các hydro ở vị trí ortho (J=8,5 Hz). Tương tự với 2 nguyên tử H-3’ và H-5’. Hai tín hiệu doublet ở các vị trí 7,18 và 6,69 ppm lần lượt thuộc về H-8 và H-6, có cùng giá trị J=2,0 Hz. Còn lại, là các tín hiệu singlet với 1 hydro thuộc về H-2, 3 hydro nhóm methyl đều xuất hiện ở dạng singlet (H-14, H-12, H-10). Không nhìn thấy tín hiệu thuộc về nguyên tử H của nhóm OH. Từ đó xác định được sự tồn tại 3 nhóm -CH3 trong cấu trúc phân tử của II.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR, 125 MHz, CDCl3): trên phổ đồ có xuất hiên các pic tín hiệu tương ứng với các nguyên tử carbon trong phân tử II. Các pic tín hiệu thuộc về C-13, C-11, C-9 (169,45; 169,40; 167,95) là các tín hiệu của 3 nhóm carbonyl ester chứng tỏ phản ứng xảy ra trên cả 3 OH phenol.