tách pha đông tụ
- Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang đa nhân
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa vi nang nhân và hỗn dịch bao gói tới quá trình tạo vi nang đa nhân
- Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii.
2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân
- Đánh giá khả năng bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang trong dung dịch pH 1.2
- Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn [4]
19
Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips, dụng cụ thủy tinh. Nguyên liệu, dụng cụ tiệt khuẩn được gói bằng giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón đậy bút bông.
Tiến hành tiệt khuẩn trong nồi hấp ở điều kiện 115℃ trong 20 phút hoặc 121℃ trong 15 phút.
Phương pháp Tyndall
Cân một lượng tinh bột nhất định cho vào trong bình nón, đậy kín bình nón bằng nút bông. Đun cách thủy ở 70℃–80℃ trong vòng 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm ở điều kiện 37℃ trong 24 giờ. Lặp lại thao tác trong 3 ngày liên tiếp.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Hoạt hóa giống
Hoạt hóa VSV từ ống giống bảo quản trong thạch nghiêng. Pha 100 ml MT1 cho vào 10 ống nghiệm (10 ml/ống), nút kín, hấp tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115℃ trong 20 phút, để nguội. Tiến hành cấy giống vào các ống nghiệm trên, ủ 24 giờ trong tủ ấm 30℃.
Nhân giống
Cân đong các thành phần trong môi trường MT1 (công thức nêu ở mục 2.1.5.a). Hòa tan các thành phần. Đậy kín bình nón bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn môi trường theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1. sau đó để nguội tới nhiệt độ 30℃
– 32℃. Cấy giống vào bình nón trên. Ủ bình nón trong máy lắc ổn nhiệt trong 24 giờ ở 30℃ với tốc độ 100 vòng/phút.
Thu sinh khối tế bào
Hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ được ly tâm bằng máy ly tâm với các thông số 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút, gạn bỏ phần dịch trong, thu sinh khối tế bào.
2.3.3. Phương pháp tạo vi nang theo nguyên tắc tách pha đông tụ
Tạo vi nang nhân alginat – tinh bột – chitosan không chứa VSV
Tiến hành tạo vi nang nhân alginat – tinh bột được gel hóa bằng dung dịch CaCl2/ Chitosan với các nồng độ cố định của các thành phần: Alginat 3%, tinh bột 10%, CaCl2 2%/Chitosan 3%. Phân tán tinh bột 10% (kl/tt) vào dung dịch natri alginat 3%, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ.
20
Vi nang nhân được hình thành bằng cách sử dụng kim tiêm 10 ml (kích thước đầu kim 25G x 1”) đùn hỗn dịch thu được ở trên vào dung dịch calci clorid 2%/Chitosan 3%. Vi nang được ngâm trong 20 phút cho gel hóa hoàn toàn sau đó vớt ra, rửa lại 3 lần với nước cất.
Tạo vi nang nhân alginat – tinh bột – chitosan chứa Saccharomyces boulardii
Phân tán tinh bột 10% (kl/tt) và sinh khối VSV thu được sau khi ly tâm vào dung dịch natri alginat 3% (phân tán theo tỷ lệ 200 ml sinh khối tương ứng với 50 ml alginat).
Tiến hành nhỏ giọt tạo vi nang tương tự như trên. Vi nang nhân tạo thành được vớt ra bằng lưới vớt hạt, rửa lại 3 lần với dung dịch NaCl 0.9%. Các thao tác được thực hiện hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng.
Tạo vi nang đa nhân
Tạo hỗn dịch màng bao gồm alginat, tinh bột theo công thức nghiên cứu. Trộn vi nang nhân với hỗn dịch màng bao theo tỷ lệ nghiên cứu. Tiến hành nhỏ giọt tạo vi nang vào dịch đông tụ chứa CaCl2 và chitosan với nồng độ và thành phần theo công thức nghiên cứu. Ngâm vi nang trong 30 phút cho gel hóa hoàn toàn. Sau đó, vi nang được vớt ra và rửa lại 3 lần với dung dịch NaCl 0,9%. Các thao tác được thực hiện hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng.
2.3.4. Phương pháp đông khô
Tiền đông
Vi nang được đựng trong các đĩa petri đã được rửa sạch hoặc tiệt khuẩn theo phương pháp 2.3.1, sau đó đông lạnh vi nang trong tủ lạnh sâu -70℃ trong 24 giờ cho đông rắn hoàn toàn nước.
Làm khô
Các mẫu vi nang sau tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô với các thông số nhiệt độ -50℃, áp suất 0.100 mbar trong 24 giờ.
Bảo quản
Các mẫu sau khi đông khô được đựng trong các đĩa petri hoặc túi zipper, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 2℃ – 8℃, độ ẩm tương đối 30%.
21
2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [4]
Chuẩn bị môi trường pha loãng và môi trường đếm
Cân đong chính xác các thành phần theo công thức MT2 (đã được nêu trong mục 2.1.5). Hòa tan các thành phần trong nước cất, chuyển dung dịch vào bình nón có thể tích thích hợp, phân tán thạch vào dung dịch, đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn hỗn dịch trong nồi hấp ở điều kiện nhiệt độ 115℃ trong 20 phút. Sau tiệt khuẩn lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường đều lên các đĩa petri đã được tiệt khuẩn, sấy khô. Yêu cầu bề mặt đĩa thạch phải nhẵn, phẳng và bề dày lớp thạch khoảng 2 mm. Chờ thạch nguội, đông rắn có thể tiến hành cấy đếm VSV.
Chuẩn bị các ống nghiệm có nắp sạch, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất để pha loãng. Đậy kín ống nghiệm hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 115℃
trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ phòng khoảng 35℃ – 37℃. Xác định số lượng VSV
Hút chính xác 1,00 ml dịch chứa tế bào VSV cần đếm vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9 ml nước cất ở trên, phân tán đều bằng máy Vortex. Sau đó lại hút 1,00 ml dịch đã đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng vào ống nghiệm thứ 2, phân tán đều bằng máy Vortex. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp. Hút 0,05 ml dịch ở trong mỗi ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, cấy trên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa lấy giá trị trung bình. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 30℃. Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa petri, lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc ở 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng.
Mỗi tế bào VSV nuôi cấy trên đĩa thạch sẽ hình thành nên một khuẩn lạc. Do đó, dựa vào số lượng khuẩn lạc đếm được ta có thể tính được số lượng VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu ban đầu theo công thức:
X = 𝐴𝑛× 10
𝑛+ 𝐴𝑛+1× 10𝑛+1+ 𝐴𝑛+2×10𝑛+2 3×𝑚×𝑉
Trong đó:
X: số lượng VSV trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu (CFU/g hoặc CFU/ml) An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 10n lần
22
m: khối lượng mẫu cân để xác định số lượng VSV (g) V: thể tích dịch cấy trải lên mỗi đĩa petri (ml)
Lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình.
2.3.6. Phương pháp phá hạt xác định số lượng VSV có trong mẫu hạt sau đông khô
Sau đông khô, lấy 1,00 g vi nang chuyển vào dung dịch natri citrat 2%. Khuấy từ cho tới khi vi nang rã hoàn toàn. Dịch phá hạt được đem đi pha loãng xác định số lượng VSV có trong mẫu theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5.
Mọi thao được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
2.3.7. Phương pháp xác định hình ảnh vi nang [7]
Sử dụng kính lúp soi nổi để xác định hình ảnh bề mặt vi nang.
Cho mẫu vi nang lên phiến kính, đặt vào vùng đặt mẫu trên phiến kính. Hiệu chỉnh độ phóng đại, vi trường để thu được hình ảnh rõ nét. Chụp lại hình ảnh soi được.
2.3.8. Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử lugol [7]
Dựa trên phản ứng màu đặc trưng của tinh bột khi phản ứng với lugol cho màu xanh tím, khi đun nóng dung dịch mất màu, để nguội màu xanh tím lại xuất hiện.
Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch lugol vào khoảng 5 ml dịch khi ủ vi nang với SGF, quan sát sự thay đổi màu sắc ở mẫu thử.
Nếu dung dịch xuất hiện màu xanh tím tức là đã có tinh bột giải phóng từ vi nang, ngược lại nếu dung dịch có màu vàng (màu của dung dịch lugol hoặc dịch lắc) chứng tỏ tinh bột không bị thất thoát trong quá trình vi nang lắc trong dung dịch pH 1.2.
2.3.9. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân [7].
Đánh giá khả năng bảo vệ VSV trong dung dịch pH 1,2
Pha 100 ml dung dịch pH 1.2 theo mục 2.1.6, hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút, để nguội về nghiệt độ từ 35℃ – 37℃.
23
Cân chính xác 1,00 g vi nang sau đông khô cho vào bình nón chứa 100 ml dung dịch pH 1.2, tiến hành ủ ở 37℃ trong máy lắc ổn nhiệt với tốc độ 75 vòng/phút. Sau 30 phút, tách vi nang và dịch lắc bằng lưới vớt hạt. Định tính tinh bột trong dịch lắc bằng phép thử lugol và cấy đếm VSV kiểm tra sự có mặt của VSV thất thoát trong dịch lắc.
Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân
Pha 100 ml dung dịch pH 1,2 và 100 ml dung dịch đệm phosphat hỗn hợp pH 6,8 (phương pháp nêu ở mục 2.1.6). Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút, để nguội về nhiệt độ khoảng 35℃ – 37℃.
Cân chính xác 1,00 g vi nang đông khô cho vào bình nón chứa 100 ml dung dịch pH 1.2. Ủ vi nang trong máy lắc ổn nhiệt với thông số nhiệt độ 37℃, tốc độ 75 vòng/phút. Tách riêng vi nang và dịch lắc bằng lưới vớt hạt đã được tiệt khuẩn.
Vi nang sau khi ủ trong dung dịch pH 1,2 được chuyển sang 100 ml dung dịch pH 6.8 lắc với tốc độ 75 vòng/phút trong máy lắc ổn nhiệt 37℃. Lấy mẫu tại 2 thời điểm : sau 2 giờ và 3 giờ ủ trong dung dịch pH 6.8. Mẫu được đem đi pha loãng xác định số lượng VSV có trong dịch lắc tại các thời điểm (phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5).
2.3.10. Phương pháp tính hiệu suất tạo vi nang
Hiệu suất tạo vi nang được tính theo công thức sau:
H= Số lượng VSV trong mẫu vi nang sau đông khô
Số lượng VSV ban đầu × 100%
Số lượng VSV ban đầu được xác định là số lượng VSV có trong 10ml sinh khối hỗn dịch tạo vi nang nhân ban đầu tính theo phương pháp pha loãng xác định số lượng VSV được trình bày ở mục 2.3.5.
Số lượng VSV trong 1,00 g vi nang sau đông khô được xác định bằng phương pháp phá hạt trình bày ở mục 2.3.6. Sau đó nhân với khối lượng mẫu vi nang sau đông khô sẽ tính được số lượng VSV trong mẫu vi nang sau đông khô.
24
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.1. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ tách pha đông tụ
Alginat là nguyên liệu phổ biến được sử dụng để bao gói vi sinh vật. Tuy nhiên nếu sử dụng đơn độc alginat có nhược điểm là cấu trúc xốp, khả năng bao gói không cao [24]. Vì thế rất nhiều nghiên cứu tiến hành kết hợp alginat với các vật liệu bao gói khác như tinh bột, chitosan nhằm hiệu quả bao gói và giải phóng hoạt chất.
Theo nhiều nghiên cứu trước đây khi phối hợp alginat, tinh bột, chitosan cho kết quả: nồng độ alginat 3%, tinh bột 10% và Chitosan 3% tạo vi nang 1 giai đoạn cho khả năng bao gói VSV tốt, khả năng bảo vệ và giải phóng VSV ổn định trong đường tiêu hóa [7]. Vì thế lựa chọn công thức này cho vi nang nhân. Nghiên cứu này tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến công thức tạo vi nang đa nhân: ảnh hưởng của nồng độ alginat và tỷ lệ giữa vi nang nhân với chất mang bên ngoài.
3.1.1. Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang đa nhân
Nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat đến khả năng bao gói các vi nang nhân trong quá trình nhỏ giọt và đông khô, tiến hành tạo vi nang đa nhân với dịch bao gói ngoài chứa alginat với nồng độ lần lượt là 0.5%; 1%; 2%; 3% và tinh bột 10% nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 2%. Vi nang nhân sẽ được tạo với nồng độ cố định của 3 thành phần alginat 3%, tinh bột 10% nhỏ giọt vào CaCl2 2%/ chitosan 3%.
Tiến hành
Tạo vi nang nhân không chứa VSV theo quy trình nêu ở mục 2.3.3.
Bao gói vi nang nhân: Vi nang nhân tạo thành được rửa với nước cất rồi chuyển vào hỗn dịch bao gói theo tỷ lệ 1:5 khuấy từ trong vòng 10 phút cho phân tán đều vi nang nhân trong hỗn dịch bao. Hỗn dịch bao gói chứa tinh bột 10% và
25
alginat với các nồng độ 0.5%; 1%; 2%; 3% ký hiệu lần lượt là A-0.5; A-1; A-2; A-3. Pha dung dịch CaCl2 2% làm dung dịch gel hóa vi nang (cách pha nêu ở mục 2.1.6). Tiến hành tạo vi nang đa nhân bằng xylanh 50 ml (kích thước đầu nhỏ giọt khoảng 4 mm). Vi nang đa nhân tạo thành được đông khô theo quy trình và các thông số đã nêu ở mục 2.3.4. Kết thúc quá trình đông khô tiến hành đánh giá về hình thái và khả năng bao gói vi nang nhân.
Kết quả:
Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả quá trình tạo vi nang đa nhân và đánh giá khả năng bao gói của các mẫu vi nang A-0.5; A-1; A-2 và A-3
Mẫu Đặc điểm
A-0.5 A-1 A-2 A-3
Khả năng hình thành giọt ở đầu xylanh
Vi nang nhân dễ bị lắng xuống khi nhỏ giọt. Khó hình thành giọt.
Vi nang nhân dễ bị lắng xuống khi nhỏ giọt. Khó hình thành giọt.
Vi nang nhân bị sa lắng ít.
Vi nang nhân ít bị lắng đọng ở đầu xylanh. Quá trình tạo giọt thuận lợi. Quá trình
tiếp xúc với dung dịch gel hóa
Không tạo thành màng bao bảo vệ. Không hình thành được vi nang.
Hình thành lớp màng mỏng bao xung quanh vi nang nhân. Hình thành hạt vi nang cầu tròn hơn. Vi nang ban đầu nổi trên bề mặt gel rồi chìm dần.
Hình thành vi nang cầu tròn đều chìm ngay khi tiếp xúc với dung dịch gel hóa.
Hình dạng vi nang tươi
Vi nang tươi không có hình dạng cầu. Lớp
Vi nang hơi cầu, không đều. Vi nang
Vi nang cầu đều, hạt ít bị kéo đuôi. Độ
26 màng co thể tích theo hình dạng của vi nang nhân bên trong. Kích thước to nhỏ không đều.
bị kéo đuôi, lộ vi nang nhân ra bề mặt. che phủ vi nang tốt. Hình dạng vi nang sau đông khô Vi nang co lại theo hình dạng của vi nang
nhân bên
trong.
Vi nang co kích thước, hạt không có hình dạng cầu đều.
Vi nang co kích thước, cứng, vẫn giữ được hình dạng cầu đều. Khả năng
bao gói vi nang
Không có khả năng bao gói.
Khả năng bao phủ không cao, chỉ hình thành lớp màng mỏng bao bọc vi nang nhân.
Vi nang nhân bị lộ hạt nhiều.
Vi nang nhân được bao phủ tốt. Ít bị lộ hạt ra bề mặt.
27
Hình 3.1: Hình ảnh vi nang tươi a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; Mẫu A-2; d) Mẫu A-3
Hình 3.2: Hình ảnh vi nang sau đông khô a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; c) Mẫu A-2: d) Mẫu A-3
c d
a b
28 Nhận xét
Khi nồng độ alginat loãng (0.5% và 1%) vi nang nhân có hiện tượng sa lắng nhiều trong quá trình nhỏ giọt. Điều này dẫn tới khó hình thành giọt đùn qua xylanh. Việc tăng nồng độ alginat lên 2% và 3% giúp vi nang nhân ít bị sa lắng hơn trong hỗn dịch bao gói. Vì thế, chất mang bên ngoài với nồng độ alginat 3%