Phương pháp đông khô

 Tiền đông

Vi nang được đựng trong các đĩa petri đã được rửa sạch hoặc tiệt khuẩn theo phương pháp 2.3.1, sau đó đông lạnh vi nang trong tủ lạnh sâu -70℃ trong 24 giờ cho đông rắn hoàn toàn nước.

 Làm khô

Các mẫu vi nang sau tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô với các thông số nhiệt độ -50℃, áp suất 0.100 mbar trong 24 giờ.

 Bảo quản

Các mẫu sau khi đông khô được đựng trong các đĩa petri hoặc túi zipper, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 2℃ – 8℃, độ ẩm tương đối 30%.

21

2.3.5. Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [4]

 Chuẩn bị môi trường pha loãng và môi trường đếm

Cân đong chính xác các thành phần theo công thức MT2 (đã được nêu trong mục 2.1.5). Hòa tan các thành phần trong nước cất, chuyển dung dịch vào bình nón có thể tích thích hợp, phân tán thạch vào dung dịch, đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn hỗn dịch trong nồi hấp ở điều kiện nhiệt độ 115℃ trong 20 phút. Sau tiệt khuẩn lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường đều lên các đĩa petri đã được tiệt khuẩn, sấy khô. Yêu cầu bề mặt đĩa thạch phải nhẵn, phẳng và bề dày lớp thạch khoảng 2 mm. Chờ thạch nguội, đông rắn có thể tiến hành cấy đếm VSV.

Chuẩn bị các ống nghiệm có nắp sạch, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất để pha loãng. Đậy kín ống nghiệm hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 115℃

trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ phòng khoảng 35℃ – 37℃.  Xác định số lượng VSV

Hút chính xác 1,00 ml dịch chứa tế bào VSV cần đếm vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9 ml nước cất ở trên, phân tán đều bằng máy Vortex. Sau đó lại hút 1,00 ml dịch đã đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng vào ống nghiệm thứ 2, phân tán đều bằng máy Vortex. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp. Hút 0,05 ml dịch ở trong mỗi ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, cấy trên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa lấy giá trị trung bình. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 30℃. Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa petri, lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc ở 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng.

Mỗi tế bào VSV nuôi cấy trên đĩa thạch sẽ hình thành nên một khuẩn lạc. Do đó, dựa vào số lượng khuẩn lạc đếm được ta có thể tính được số lượng VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu ban đầu theo công thức:

X = 𝐴𝑛× 10

𝑛+ 𝐴𝑛+1× 10𝑛+1+ 𝐴𝑛+2×10𝑛+2 3×𝑚×𝑉

Trong đó:

X: số lượng VSV trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu (CFU/g hoặc CFU/ml) An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 10n lần

22

m: khối lượng mẫu cân để xác định số lượng VSV (g) V: thể tích dịch cấy trải lên mỗi đĩa petri (ml)

Lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình.

2.3.6. Phương pháp phá hạt xác định số lượng VSV có trong mẫu hạt sau đông khô

Sau đông khô, lấy 1,00 g vi nang chuyển vào dung dịch natri citrat 2%. Khuấy từ cho tới khi vi nang rã hoàn toàn. Dịch phá hạt được đem đi pha loãng xác định số lượng VSV có trong mẫu theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5.

Mọi thao được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.

2.3.7. Phương pháp xác định hình ảnh vi nang [7]

Sử dụng kính lúp soi nổi để xác định hình ảnh bề mặt vi nang.

Cho mẫu vi nang lên phiến kính, đặt vào vùng đặt mẫu trên phiến kính. Hiệu chỉnh độ phóng đại, vi trường để thu được hình ảnh rõ nét. Chụp lại hình ảnh soi được.

2.3.8. Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử lugol [7]

Dựa trên phản ứng màu đặc trưng của tinh bột khi phản ứng với lugol cho màu xanh tím, khi đun nóng dung dịch mất màu, để nguội màu xanh tím lại xuất hiện.

Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch lugol vào khoảng 5 ml dịch khi ủ vi nang với SGF, quan sát sự thay đổi màu sắc ở mẫu thử.

Nếu dung dịch xuất hiện màu xanh tím tức là đã có tinh bột giải phóng từ vi nang, ngược lại nếu dung dịch có màu vàng (màu của dung dịch lugol hoặc dịch lắc) chứng tỏ tinh bột không bị thất thoát trong quá trình vi nang lắc trong dung dịch pH 1.2.

2.3.9. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân [7].

 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV trong dung dịch pH 1,2

Pha 100 ml dung dịch pH 1.2 theo mục 2.1.6, hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút, để nguội về nghiệt độ từ 35℃ – 37℃.

23

Cân chính xác 1,00 g vi nang sau đông khô cho vào bình nón chứa 100 ml dung dịch pH 1.2, tiến hành ủ ở 37℃ trong máy lắc ổn nhiệt với tốc độ 75 vòng/phút. Sau 30 phút, tách vi nang và dịch lắc bằng lưới vớt hạt. Định tính tinh bột trong dịch lắc bằng phép thử lugol và cấy đếm VSV kiểm tra sự có mặt của VSV thất thoát trong dịch lắc.

 Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân

Pha 100 ml dung dịch pH 1,2 và 100 ml dung dịch đệm phosphat hỗn hợp pH 6,8 (phương pháp nêu ở mục 2.1.6). Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút, để nguội về nhiệt độ khoảng 35℃ – 37℃.

Cân chính xác 1,00 g vi nang đông khô cho vào bình nón chứa 100 ml dung dịch pH 1.2. Ủ vi nang trong máy lắc ổn nhiệt với thông số nhiệt độ 37℃, tốc độ 75 vòng/phút. Tách riêng vi nang và dịch lắc bằng lưới vớt hạt đã được tiệt khuẩn.

Vi nang sau khi ủ trong dung dịch pH 1,2 được chuyển sang 100 ml dung dịch pH 6.8 lắc với tốc độ 75 vòng/phút trong máy lắc ổn nhiệt 37℃. Lấy mẫu tại 2 thời điểm : sau 2 giờ và 3 giờ ủ trong dung dịch pH 6.8. Mẫu được đem đi pha loãng xác định số lượng VSV có trong dịch lắc tại các thời điểm (phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5).

2.3.10. Phương pháp tính hiệu suất tạo vi nang

Hiệu suất tạo vi nang được tính theo công thức sau:

H= Số lượng VSV trong mẫu vi nang sau đông khô

Số lượng VSV ban đầu × 100%

Số lượng VSV ban đầu được xác định là số lượng VSV có trong 10ml sinh khối hỗn dịch tạo vi nang nhân ban đầu tính theo phương pháp pha loãng xác định số lượng VSV được trình bày ở mục 2.3.5.

Số lượng VSV trong 1,00 g vi nang sau đông khô được xác định bằng phương pháp phá hạt trình bày ở mục 2.3.6. Sau đó nhân với khối lượng mẫu vi nang sau đông khô sẽ tính được số lượng VSV trong mẫu vi nang sau đông khô.

24

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1. Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ tách pha đông tụ

Alginat là nguyên liệu phổ biến được sử dụng để bao gói vi sinh vật. Tuy nhiên nếu sử dụng đơn độc alginat có nhược điểm là cấu trúc xốp, khả năng bao gói không cao [24]. Vì thế rất nhiều nghiên cứu tiến hành kết hợp alginat với các vật liệu bao gói khác như tinh bột, chitosan nhằm hiệu quả bao gói và giải phóng hoạt chất.

Theo nhiều nghiên cứu trước đây khi phối hợp alginat, tinh bột, chitosan cho kết quả: nồng độ alginat 3%, tinh bột 10% và Chitosan 3% tạo vi nang 1 giai đoạn cho khả năng bao gói VSV tốt, khả năng bảo vệ và giải phóng VSV ổn định trong đường tiêu hóa [7]. Vì thế lựa chọn công thức này cho vi nang nhân. Nghiên cứu này tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến công thức tạo vi nang đa nhân: ảnh hưởng của nồng độ alginat và tỷ lệ giữa vi nang nhân với chất mang bên ngoài.

3.1.1. Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang đa nhân

Nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat đến khả năng bao gói các vi nang nhân trong quá trình nhỏ giọt và đông khô, tiến hành tạo vi nang đa nhân với dịch bao gói ngoài chứa alginat với nồng độ lần lượt là 0.5%; 1%; 2%; 3% và tinh bột 10% nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 2%. Vi nang nhân sẽ được tạo với nồng độ cố định của 3 thành phần alginat 3%, tinh bột 10% nhỏ giọt vào CaCl2 2%/ chitosan 3%.

 Tiến hành

Tạo vi nang nhân không chứa VSV theo quy trình nêu ở mục 2.3.3.

Bao gói vi nang nhân: Vi nang nhân tạo thành được rửa với nước cất rồi chuyển vào hỗn dịch bao gói theo tỷ lệ 1:5 khuấy từ trong vòng 10 phút cho phân tán đều vi nang nhân trong hỗn dịch bao. Hỗn dịch bao gói chứa tinh bột 10% và

25

alginat với các nồng độ 0.5%; 1%; 2%; 3% ký hiệu lần lượt là A-0.5; A-1; A-2; A-3. Pha dung dịch CaCl2 2% làm dung dịch gel hóa vi nang (cách pha nêu ở mục 2.1.6). Tiến hành tạo vi nang đa nhân bằng xylanh 50 ml (kích thước đầu nhỏ giọt khoảng 4 mm). Vi nang đa nhân tạo thành được đông khô theo quy trình và các thông số đã nêu ở mục 2.3.4. Kết thúc quá trình đông khô tiến hành đánh giá về hình thái và khả năng bao gói vi nang nhân.

 Kết quả:

Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả quá trình tạo vi nang đa nhân và đánh giá khả năng bao gói của các mẫu vi nang A-0.5; A-1; A-2 và A-3

Mẫu Đặc điểm

A-0.5 A-1 A-2 A-3

Khả năng hình thành giọt ở đầu xylanh

Vi nang nhân dễ bị lắng xuống khi nhỏ giọt. Khó hình thành giọt.

Vi nang nhân dễ bị lắng xuống khi nhỏ giọt. Khó hình thành giọt.

Vi nang nhân bị sa lắng ít.

Vi nang nhân ít bị lắng đọng ở đầu xylanh. Quá trình tạo giọt thuận lợi. Quá trình

tiếp xúc với dung dịch gel hóa

Không tạo thành màng bao bảo vệ. Không hình thành được vi nang.

Hình thành lớp màng mỏng bao xung quanh vi nang nhân. Hình thành hạt vi nang cầu tròn hơn. Vi nang ban đầu nổi trên bề mặt gel rồi chìm dần.

Hình thành vi nang cầu tròn đều chìm ngay khi tiếp xúc với dung dịch gel hóa.

Hình dạng vi nang tươi

Vi nang tươi không có hình dạng cầu. Lớp

Vi nang hơi cầu, không đều. Vi nang

Vi nang cầu đều, hạt ít bị kéo đuôi. Độ

26 màng co thể tích theo hình dạng của vi nang nhân bên trong. Kích thước to nhỏ không đều.

bị kéo đuôi, lộ vi nang nhân ra bề mặt. che phủ vi nang tốt. Hình dạng vi nang sau đông khô Vi nang co lại theo hình dạng của vi nang

nhân bên

trong.

Vi nang co kích thước, hạt không có hình dạng cầu đều.

Vi nang co kích thước, cứng, vẫn giữ được hình dạng cầu đều. Khả năng

bao gói vi nang

Không có khả năng bao gói.

Khả năng bao phủ không cao, chỉ hình thành lớp màng mỏng bao bọc vi nang nhân.

Vi nang nhân bị lộ hạt nhiều.

Vi nang nhân được bao phủ tốt. Ít bị lộ hạt ra bề mặt.

27

Hình 3.1: Hình ảnh vi nang tươi a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; Mẫu A-2; d) Mẫu A-3

Hình 3.2: Hình ảnh vi nang sau đông khô a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; c) Mẫu A-2: d) Mẫu A-3

c d

a b

28  Nhận xét

Khi nồng độ alginat loãng (0.5% và 1%) vi nang nhân có hiện tượng sa lắng nhiều trong quá trình nhỏ giọt. Điều này dẫn tới khó hình thành giọt đùn qua xylanh. Việc tăng nồng độ alginat lên 2% và 3% giúp vi nang nhân ít bị sa lắng hơn trong hỗn dịch bao gói. Vì thế, chất mang bên ngoài với nồng độ alginat 3% ổn định tốt hơn và quá trình nhỏ giọt diễn ra dễ dàng hơn.

Hỗn dịch bao gói ngoài với nồng độ alginat 0.5% không thể tạo được màng bao bảo vệ khi giọt đùn tiếp xúc với dung dịch gel hóa. Tăng nồng độ alginat lên 3% tạo ra màng bao chắc chắn, vi nang cầu đều và ổn định cấu trúc hơn khi đông khô.

Qua khảo sát nồng độ alginat 1%, 2% và 3% có khả năng tạo được vi nang đa nhân. Tuy nhiên, mật độ vi nang nhân trong mỗi vi nang tạo thành không đồng đều và phụ thuộc vào nồng độ alginat của dịch bao gói ngoài. Có thể thấy, việc tăng nồng độ alginat lên 3% giúp cho sự phân tán vi nang nhân trong hỗn dịch bao gói đồng nhất hơn (Hình 3.1.d – nồng độ alginat 3%). Vì thế sẽ giúp tăng hiệu quả bao gói và phân phối VSV trong vi nang đa nhân.

 Bàn luận

Từ kết quả thí nghiệm có thể thấy nồng độ alginat rõ ràng có ảnh hưởng đến quá trình nhỏ giọt tạo vi nang đa nhân cũng như khả năng tạo ra các vi nang đồng nhất.

Việc tăng nồng độ alginat lên 3% cũng giúp vi nang đạt được sự đồng đều về mật độ nhân trong mỗi vi nang đa nhân. Do khi tăng nồng độ alginat dẫn tới tăng độ nhớt của hỗn dịch bao gói ngoài [15]. Điều này giúp cho vi nang nhân ít bị sa lắng hơn trong quá trình bao gói và tạo ra các vi nang đồng đều về số lượng vi nang nhân.

Tăng nồng độ alginat giúp tăng khả năng bao gói vi nang nhân nhờ hình thành màng bao chắc chắn. Điều này có thể được giải thích khi nồng độ alginat càng thấp thì mật độ tập trung alginat trong mỗi giọt được đùn ra khỏi xylanh thấp. Do đó khả năng liên kết chéo với ion Ca2+ để hình thành hạt giảm. Khi nồng độ alginat thấp, liên kết lỏng lẻo hình thành giữa alginat và ion Ca2+ không đủ để

29

bao phủ được vi nang nhân bên trong dẫn tới việc giọt chứa vi nang nhân bị phân tán trở lại khi tiếp xúc với dung dịch gel hóa hoặc chỉ hình thành màng mỏng không đồng nhất (Hình 3.1.a – Alginat 0.5%). Ở nồng độ alginat 2% và 3% có mật độ alginat cao hơn vì thế khi tiếp xúc với dung dịch gel hóa, giọt sẽ xảy ra ngay quá trình gel hóa bên ngoài để ổn định cấu trúc hạt. Sau đó Ca2+ sẽ tiếp tục thâm nhập vào bên trong và hình thành vi nang có cấu trúc chắc chắn [13]. Ngoài ra, việc tăng nồng độ alginat giúp vi nang nhân ít bị sa lắng cũng ảnh hưởng tới khả năng bao gói vi nang. Khi sử dụng alginat nồng độ 0.5% hay 1% thì hỗn dịch bao gói có độ nhớt thấp [15], vi nang nhân bị lắng đọng tại đầu xylanh dẫn tới việc mỗi giọt được đùn ra sẽ chứa từ 4 – 7 vi nang nhân, chiếm thể tích xấp xỉ kích thước đầu xylanh. Do đó không còn nhiều khoảng trống cho hỗn dịch bao gói để hình thành màng bao chắc chắn, dẫn tới khả năng bao phủ vi nang nhân giảm.

Như vậy với kỳ vọng tạo được vi nang đa nhân với khả năng bao gói vi nang nhân tốt thì công thức vi nang nhân alginat 3% - tinh bột 10% với dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3% và hỗn dịch bao gói vi nang nhân được lựa chọn là: alginat 3% - tinh bột 10% nhỏ vào dung dịch gel hóa CaCl2 2%.

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa vi nang nhân và hỗn dịch bao gói tới quá trình tạo vi nang đa nhân

 Tiến hành:

Tạo vi nang nhân theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3.

Bao gói vi nang nhân: Vi nang nhân tạo thành được rửa với nước cất rồi chuyển vào hỗn dịch bao gói chứa alginat 3% và tinh bột 10% theo tỷ lệ giữa nhân và hỗn dịch bao gói là 1: 2.5 ; 1: 5 ; 1: 10, khuấy từ trong vòng 10 phút cho phân tán đều vi nang nhân trong hỗn dịch bao. Pha dung dịch CaCl2 2% làm dung dịch gel hóa vi nang (cách pha nêu ở mục 2.1.6). Tiến hành tạo vi nang đa nhân bằng