Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii- 123docz.net

a. Tiến hành

Hoạt hóa giống Saccharomyces boulardii trong môi trường nhân giống nấm men rồi sau đó nhân giống vào 200 ml MT1, tiến hành ly tâm thu sinh khối (phương pháp nêu ở mục 2.3.2).

Chuẩn bị 50 ml hỗn dịch tạo vi nang nhân gồm: 50 ml natri alginat 3% tiệt khuẩn theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1; 5,00 g tinh bột đã tiệt khuẩn và sinh khối VSV sau khi ly tâm (thu được bằng máy lắc Vortex). Khuấy từ trong vòng 20 phút để đồng nhất hỗn dịch.

2 cốc có mỏ 100 ml đều đã được tiệt khuẩn theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.1.

Dùng xylanh 10 ml hút chính xác 10 ml hỗn dịch tạo vi nang nhân đùn vào mỗi cốc. Ngâm vi nang nhân trong 20 phút cho gel hóa hoàn toàn. Vi nang nhân sau gel hóa được rửa sạch với dung dịch NaCl 0.9% 3 lần. Thu được 2 mẫu vi nang nhân.

 Bao vi nang nhân

Hỗn dịch bao vi nang nhân: Hai mẫu vi nang nhân được cho vào các cốc có mỏ có sẵn 50 ml alginat 3% và 5,00 g tinh bột đã được tiệt khuẩn và phân tán đều. Dùng máy khuấy từ đến khi đồng nhất nhân trong hỗn dịch bao. Tạo 2 mẫu vi nang đa nhân theo quy trình sau:

 Hỗn dịch bao chứa vi nang nhân được nhỏ vào dung dịch gel hóa vi nang Calci clorid 2%/Chitosan 3% đã tiệt khuẩn thu được vi nang ATC – ATC

 Hỗn dịch bao chứa vi nang nhân được nhỏ vào dung dịch gel hóa vi nang Calci clorid 2% đã tiệt khuẩn thu được vi nang ATC – AT

Ngâm vi nang trong 30 phút để gel hóa hoàn toàn. Vi nang tươi được rửa với dung dịch NaCl 0,9% 3 lần. Mẫu vi nang được đem đi đông khô theo các bước đã nêu ở mục 2.3.4. Tất cả thao tác tạo vi nang đều được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.

Hình 3.6: Sơ đồ các bước tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii

Vi nang sau đông khô được đánh giá một số đặc tính về cảm quan và tính hiệu suất tạo vi nang.

b. Hình thái vi nang

 Kết quả, nhận xét

Hình 3.7: Hình ảnh vi nang ATC – AT a) Trước đông khô b) Sau đông khô

Alginat 3% + Tinh bột 10% + Sinh khối VSV

Dung dịch gel hóa: CaCl2 2%/ Chitosan 3%

Hỗn dịch bao nhân : Alginat 3% + Tinh bột 10%

CaCl2 2%/Chitosan 3% ATC - ATC CaCl2 2% ATC - AT Tạo vi nang nhân a b

Hình 3.8: Hình ảnh vi nang ATC-ATC a) Trước đông khô; b) Sau đông khô

Hình 3.9: a) Vi nang ATC – ATC; b) Vi nang ATC – AT dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 25X

Về cảm quan, vi nang ATC – AT và vi nang ATC – ATC đều có hình dạng không cầu đều, bề mặt không nhẵn, thể chất khô cứng và tách rời. Mẫu ATC – ATC có màu nâu đậm hơn so với mẫu ATC – AT do có lớp chitosan bao phủ bên ngoài tạo nên màu sắc cho vi nang.

 Bàn luận

Bề mặt của vi nang không nhẵn do vi nang khi đông khô làm thăng hoa các phân tử nước dẫn tới vi nang co rút thể tích [33].Do sự sắp xếp của vi nang nhân bên trong không đạt được sự đồng nhất nên bề mặt vi nang sẽ không nhẵn và không đồng đều giữa các vi nang.

c. Hiệu suất tạo vi nang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

b a

Hiệu suất tạo vi nang được tính theo phương pháp nêu ở mục 2.3.10.

Bảng 3.4: Hiệu suất tạo vi nang

Mẫu Số lượng VSV

Vi nang ATC - AT Vi nang ATC – ATC Số lượng VSV ban đầu

(log CFU/ml) 7,37 7,37

Vi nang sau đông khô

(log CFU/g) 6,32 6,62

Hiệu suất tạo vi nang 85,75% 89.82%

Hiệu suất tạo vi nang của 2 mẫu ATC – AT và ATC – ATC đạt được lần lượt là 85.75% và 89,82%. Không có sự khác biệt lớn giữa hai mẫu. VSV trong vi nang giảm so với lượng sinh khối ban đầu có thể do thất thoát trong quá trình nhỏ giọt tạo vi nang hoặc chết do khuấy trộn, ngâm hoặc trong quá trình đông khô.

3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân

Theo định nghĩa của FAO/WHO, probiotic chỉ phát huy được tác dụng có lợi cho vật chủ khi đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ, cụ thể là khi vào tới ruột số lượng VSV phải đạt được tối thiểu là 6 – 7 log CFU/g (theo tiêu chuẩn của FAO/WHO đối với chế phẩm probiotic) [22].Vì thế bên cạnh vai trò bảo vệ và duy trì khả năng sống sót của VSV khi đi qua đường tiêu hóa thì vi nang cần phải có khả năng giải phóng VSV khi đi tới vị trí tác dụng là tại ruột.

Các nghiên cứu tiếp theo được thiết kế nhằm mục đích đánh giá khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii khi được bao gói trong vi nang đa nhân trong dịch dạ dày mô phỏng và khả năng giải phóng VSV trong dịch ruột mô phỏng.

3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang trong dung dịch pH 1.2

Ủ 1,00 g mẫu vi nang trong 100 ml dung dịch pH 1.2 (phương pháp nêu ở mục 2.3.9). Lấy 5 µl dịch lắc đem đếm VSV thất thoát theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5. Lấy 5 ml dịch acid sau lắc định tính tinh bột bằng thuốc thử Lugol (phương pháp nêu ở mục 2.3.8).

 Kết quả

Sau khi lắc với dung dịch pH 1.2, quan sát thấy vi nang có sự trương nở về mặt kích thước, dịch ủ trong suốt có màu vàng nhạt ở mẫu ATC – ATC, dịch lắc cả 2 mẫu âm tính với phép thử định tính tinh bột. Dịch lắc của cả 2 mẫu vi nang đều cho kết quả không có VSV thất thoát ra ngoài hoặc số lượng VSV thất thoát quá ít dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp đếm VSV.

Hình 3.10: Kết quả thử định tính tinh bột trong dung dịch pH 1.2 sau 30 phút của các mẫu vi nang ATC – AT và ATC – ATC (theo thứ tự từ trái

qua phải)

 Bàn luận

Sau thời gian lắc trong dung dịch pH 1.2, các mẫu vi nang đều có dấu hiệu trương nở về mặt cảm quan bên ngoài nhưng không có sự thất thoát vi nang nhân hay VSV ra ngoài cho thấy khả năng bảo vệ VSV cao trong dung dịch pH 1.2 của cả 2 mẫu vi nang. Cơ chế bảo vệ VSV được lý giải như sau: Vi nang calci alginat được hình thành thông qua mô hình hộp trứng được tạo bởi alginat và Ca2+ bẫy các VSV trong đó; trong môi trường pH 1.2, ion H+ sẽ trao đổi với ion Ca2+ làm mất cấu trúc hộp trứng; điều này dẫn tới các VSV có thể thất thoát ra ngoài; tuy

nhiên việc bẫy VSV trong nhân và bao thêm một lớp bên ngoài vi nang nhân giúp giảm đáng kể sự tác động trực tiếp của việc trao đổi ion tới lớp nhân bên trong.

Ngoài ra, ở vi nang nhân ATC – ATC việc sử dụng chitosan trong bao gói đã làm tăng hiệu quả bảo vệ. Do chitosan tan ở pH thấp và trong dung dịch pH 1.2 alginat giảm sự tích điện. Vì thế, chitosan trao đổi với ion H+ giúp giảm thiểu sự mất mát ion Ca2+ [16]. Do đó, dịch lắc pH 1.2 của mẫu ATC – ATC có màu vàng nhạt do chitosan thất thoát ra ngoài.

3.2.2. Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân

 Tiến hành

Ủ 1,00 g mẫu vi nang vào 100 ml dung dịch pH 1.2 sau đó tiếp tục ủ với dung dịch pH 6.8 (phương pháp nêu ở mục 2.3.9). Hút chính xác 1,00 ml dịch và xác định số lượng VSV đã giải phóng khi đi qua dịch tiêu hóa mô phỏng theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu ở mục 2.3.5.

 Kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Kết quả đếm số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm 2,5 giờ và 3,5 giờ được trình bày trong bảng dưới đây:

Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm khác nhau

Mẫu Thời gian ủ

Số lượng VSV (log CFU/g)

ATC – ATC ATC - AT

Mẫu phá hạt 5,72 5,41

Sau 2,5 giờ 4,83 5,03

Sau 3,5 giờ 5,21 5,10

 Nhận xét

Tại thời điểm sau khi ủ 2,5 giờ số lượng VSV giải phóng của vi nang đa nhân ATC – AT là 5,03 log CFU/g nhiều hơn lượng VSV giải phóng ra của mẫu vi nang đa nhân ATC – ATC là 4,83 log CFU/g. Tại thời điểm 3.,5 giờ mẫu ATC – ATC có số lượng VSV giải phóng ra nhiều hơn.

Hình 3.11: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng trong dịch tiêu hóa mô phỏng tại các thời điểm khác nhau

 Bàn luận

So sánh 2 mẫu vi nang sau 30 phút ủ trong dung dịch pH 1.2 và 2 giờ ủ trong dung dịch pH 6.8, mẫu vi nang có chứa chitosan trong lớp bao ngoài là ATC – ATC có số lượng VSV giải phóng ra thấp hơn so với mẫu không chứa chitosan ATC – AT. Tiếp tục ủ trong dung dịch pH 6.8 thêm 1 giờ thì mẫu ATC – ATC lại giải phóng ra số lượng VSV nhiều hơn so với mẫu còn lại. Có thể dễ dàng nhận thấy tốc độ giải phóng VSV của mẫu vi nang ATC – ATC ban đầu chậm hơn so với mẫu ATC – AT, sau đó tốc độ giải phóng của mẫu vi nang ATC – ATC lại nhanh hơn mẫu còn lại thông qua biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng hình 3.11.

Điều này có thể giải thích do đặc tính của chitosan không tan ở pH trên 6,0 [40]. Vì thế giai đoạn đầu trong dung dịch pH 6,8, mẫu ATC – ATC có chứa chitosan trong lớp bao ngoài sẽ cản trở sự giải phóng vi nang nhân ra ngoài. Theo thời gian vi nang sẽ hút nước trương nở làm mất tác dụng của chitosan lớp bao ngoài. Vì thế vi nang nhân cũng như vi sinh vật sẽ giải phóng nhanh chóng ở giai đoạn sau. 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8

0 giờ 2 giờ 30 phút 3 giờ 30 phút

Số lượ n g VSV (log CFU /g)

Thời gian vi nang trong đường tiêu hóa (giờ)

Ngoài ra, ở pH cao trên 6,5 chitosan giảm tích điện vì thế tương tác với phân tử anion alginat giảm [16]. Do đó, tại thời điểm 3,5 giờ mẫu ATC – ATC đạt được số lượng giải phóng VSV nhiều hơn. Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hằng đã đưa ra kết quả tương tự, trong môi trường dịch ruột mô phỏng mẫu vi nang bao đa lớp có chứa chitosan giải phóng chậm hơn tại 2 giờ nhưng tốc độ giải phóng nhanh hơn trong khoảng 2 – 3 giờ so với mẫu vi nang bao một lớp và mẫu bao 2 lớp không có chitosan [7]. Như vậy, mẫu vi nang đa nhân có bao chitosan lớp ngoài cùng đem lại kỳ vọng về khả năng có thể vận chuyển VSV đi xa hơn trong đường tiêu hóa.

Sau 3,5 giờ thử giải phóng thì ở cả 2 mẫu vi nang đều có số lượng VSV giải phóng thấp hơn kỳ vọng là 6 – 7 log CFU/g (yêu cầu về chế phẩm probiotic của FAO/WHO). Vì vậy để cải thiện số lượng VSV giải phóng ra khỏi chế phẩm trong dịch tiêu hóa cần phải nâng số lượng VSV trong hỗn dịch tạo vi nang nhân ban đầu.

Như vậy, vi nang đa nhân có lớp bao ngoài có hoặc không có chitosan đều có khả năng bảo vệ tốt VSV trong dung dịch pH 1,2. Vi nang đa nhân có lớp bao ngoài chứa chitosan có xu hướng kéo dài thời gian giải phóng VSV. Cụ thể tại thời điểm 2,5 giờ thử giải phóng, mẫu có chitosan bao ngoài cho số lượng VSV giải phóng thấp hơn mẫu không có chitosan. Nhưng tại thời điểm 3,5 giờ, mẫu có chitosan lại có số lượng VSV giải phóng cao hơn mẫu còn lại. Kết quả cho thấy, chitosan có xu hướng ảnh hướng tới khả năng giải phóng VSV ra khỏi vi nang trong dịch tiêu hóa mô phỏng.

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận

Sau thời gian nghiên cứu đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và có được một số kết quả chính như sau:

4.1.1. Đã khảo sát và lựa chọn được một số thông số tối ưu tạo được vi nang đa nhân gồm:

 Vi nang nhân: Hỗn dịch tạo vi nang nhân chứa natri alginat 3%, tinh bột 10%, sinh khối VSV và dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3%.

 Hỗn dịch bao gói ngoài chứa natri alginat 3%, tinh bột 10%; dung dịch gel hóa là CaCl2 2% hoặc CaCl2 2%/ chitosan 3%.

 Tỷ lệ vi nang nhân và hỗn dịch bao gói: 1:5

Công thức tạo vi nang cho kết quả khả quan để tạo được vi nang nhân tròn đều, tách rời, bề mặt không lộ hạt và khả năng bao gói VSV cao. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

4.1.2. Đã đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân tạo thành trong dịch tiêu hóa mô phỏng. Kết quả cho thấy:

 Vi nang đa nhân có lớp bao ngoài có hoặc không có chitosan đều có khả năng bảo vệ tốt VSV trong dung dịch pH 1,2.

 Chitosan trong hỗn dịch bao gói ngoài có xu hướng ảnh hưởng tới khả năng giải phóng VSV ra khỏi vi nang đa nhân. Tại thời điểm 2,5 giờ mẫu ATC – ATC cho số lượng VSV giải phóng thấp hơn mẫu ATC – AT. Còn tại thời điểm 3,5 giờ, mẫu ATC – ATC lại có số lượng VSV giải phóng cao hơn mẫu ATC – AT.

4.2. Đề xuất

Bên cạnh những kết quả đạt được, do thời gian làm khóa luận còn hạn chế nên đề tài xin được đưa ra một số đề xuất nhằm hoàn thiện và nâng cao tính ứng dụng thực tế như sau:

1. Nghiên cứu các biện pháp gia tăng độ đồng đều của nhân trong vi nang, tiến hành đánh giá lặp lại thí nghiệm giải phóng để khẳng định kết quả.

2. Theo dõi độ ổn định của vi nang đa nhân trong quá trình bảo quản để đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang đa nhân theo thời gian.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Thị Hoàng Anh (2020), Khảo sát quá trình tạo vi nang đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus và Saccharomyces boulardii, Khóa luận tốt

nghiệp DSĐH, Trường đại học Dược Hà Nội.

2. Ngô Nguyễn Quỳnh Anh (2020), Nghiên cứu tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus và Saccaromyces boulardii, Luận văn thạc sĩ

dược học, Trường đại học Dược Hà Nội.

3. Bộ môn bào chế - Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề về bào

chế hiện đại Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.112 - 128.

4. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội,

PL.16.1, tr.414-415.

5. Trần Cát Đông (2015), Xu hướng nghiên cứu và ứng dụng chủng lợi khuẩn

probiotic trong y học và thực phẩm chức năng, Trung tâm Thông tin Khoa

học và Công nghệ TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh.

6. Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi Sinh Vật học Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr.221 - 228.

7. Nguyễn Thị Hằng (2020), Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật trong đường

tiêu hóa của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp, Khóa luận tốt

nghiệp DSĐH, Trường đại học Dược Hà Nội.

8. Từ Minh Kóong (2017), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II: Kỹ thuật sản

xuất thuốc bằng phương pháp sinh tổng hợp, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

9. Đàm Thanh Xuân và cộng sự (2015), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ", Tạp chí Dược học, tr.61-65.

Tài liệu tiếng Anh

10. Arslan Sultan, Erbas Mustafa, et al (2015), "Microencapsulation of probiotic Saccharomyces cerevisiae var. boulardii with different wall materials by spray drying", LWT-Food Science Technology, 63(1), pp.685- 690.

11. Asgari Shadi, Pourjavadi Ali, et al (2020), "Polymeric carriers for enhanced delivery of probiotics", Advanced Drug Delivery Reviews. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

12. Berger Jerome, Reist Marianne, et al (2004), "Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications", European journal of Pharmaceutics Biopharmaceutics,

57(1), pp.35-52.

13. Blandino Ana, Macias Manuel, et al (1999), "Formation of calcium alginate gel capsules: influence of sodium alginate and CaCl2 concentration on

Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii

Phương pháp đông khô