Cho đến nay, chức năng và cơ chế hoạt động của kênh protein 3a của SARS- CoV-2 chưa được nghiên cứu rõ ràng. Do đó, việc phân tích cấu trúc không gian của protein là cần thiết để đưa ra định hướng cho thiết kế de novo. Khi phân tích cấu trúc tinh thể của kênh protein 3a, chúng tôi không quan sát thấy có đường thấm liên tục xuyên màng. Như đã trình bày trong phần tổng quan, toàn bộ kênh protein 3a được chia làm ba miền gồm đầu N ngoại bào, miền xuyên màng và đầu C ngoại bào. Chúng tôi chia đầu N ngoại bào làm 6 đoạn đánh số từ 1-6 (Hình 3.2-A).
Từ phía bên ngoài tế bào, có bốn đoạn đầu tiên là kỵ nước (Hình 3.2-B, C, D, E). Các gốc Phe43 đối lập nhau ở đầu TM1 tạo ra hai đường dẫn vào kênh có bán kính nhỏ hơn 1,5 Å. Các đường dẫn sau đó hợp nhất và đi qua một loạt các đoạn hẹp có bán kính khoảng 1 Å được xếp bởi Leu46 và Leu47, Val50 và Val58, cuối cùng là Leu53 và Leu85. Hai đoạn tiếp theo thân nước và được mở rộng hơn (Hình 3.2-F, G). Hai Gln57 rất gần nhau từ các TM1 đối lập chia khoang trong ra làm hai đường có bán kính khoảng 2 Å và được giới hạn với Cys81 từ TM2. Đoạn thứ sáu có bán kính khoảng 4 Å được giới hạn bởi Ser60 và Lys61 từ TM1 và His78 từ TM2.
Sáu đoạn thắt đầu tiên tính từ ngoại bào đều bị thu hẹp đến bán kính khoảng 1 Å là quá nhỏ đối với sự dẫn truyền của các cation qua màng. Do đó, con đường dẫn truyền cation qua kênh protein 3a có thể đi theo con đường khác mà không đi qua đường thấm liên tục xuyên màng. Tính từ đầu N ngoại bào đến vị trí đoạn thứ sáu khoảng 30 Å. Như vậy, các đoạn tiếp theo của kênh protein 3a sẽ bắt đầu từ màng tế bào dẫn qua lớp lipid kép vào trong nội bào. Chúng tôi dự đoán rằng có thể dòng cation đi qua protein 3a không đi từ đầu N mà có thể đi từ vị trí tiếp xúc với màng tế bào của kênh protein.
23
A B C
D E
F G
Hình 3.2. Phần ngoại bào trong cấu trúc protein 3a của SARS-CoV-2
(A) Phân bố các vùng trên protein 3a SARS-CoV-2 nhìn từ mặt bên. (B-E) Bốn đoạn thân dầu trên protein 3a tương ứng với đoạn 1-4. (F, G) Hai đoạn thân nước trên protein 3a tương ứng với đoạn 5, 6.
24
Từ đoạn thứ 6 đi xuống miền nội bào, chúng tôi thấy có một khoang cực lớn ở nửa trong của vùng TM. Khoang này liên thông với nội bào và lớp lipid kép thông qua hai đường hầm mở: đường hầm trên và đường hầm dưới (Hình 3.3). Các đường hầm phía trên được hình thành giữa TM2 và TM3 trong mỗi tiểu đơn vị và có khả năng mở ra ngoại bào. Các đường hầm phía dưới chạy bên dưới liên kết giữa TM1 và TM2 và phía trên vùng nội bào và mở ra dịch nội bào. Các đường hầm bên dưới là những con đường mở cho sự di chuyển của ion và nước giữa nội bào và khoang lớn. Có thể quan sát thấy mạng lưới các phân tử nước đi theo dòng kéo dài qua các đường hầm, khoang lớn và vùng nội bào. Khoang lớn là khu vực trung chuyển ion và nước giữa hai đường hầm trên và dưới.
Cấu trúc của đường hầm trên và đường hầm dưới phù hợp hơn với đường dẫn truyền cation qua kênh protein 3a, do đó chúng tôi đề xuất rằng đường hầm trên dẫn ion và nước vào khoang lớn, sau đó ion và nước được đưa từ khoang lớn vào nội bào qua đường hầm dưới.
Hình 3.3. Đường hầm trên và đường hầm dưới của kênh protein 3a SARS-CoV-2
(A) Đường hầm trên nhìn từ mặt bên. (B) Đường hầm dưới nhìn từ mặt bên. (C) Bề mặt protein nhìn từ ngoại bào, mũi tên màu vàng hướng vào chỉ dòng nước và ion đi từ ngoại bào vào đường hầm trên, mũi tên màu đỏ hướng ra chỉ dòng nước và ion đi từ đường hầm dưới vào nôi bào. (D) Đường hầm trên và đường hầm dưới được mô hình hóa khi nhìn từ phía ngoại bào.
A B C
25
Tính toán khả năng gắn phân tử thuốc bằng công cụ CavityPlus xác định 13 miền có khả năng liên kết với phối tử. Trong đó miền số 5 có điểm gắn thuốc và khả năng gắn thuốc cao nhất chính là khu vực khoang lớn và các đường hầm (Bảng 3.1). Do đó, nghiên cứu này tập trung vào thiết kế các hợp chất có khả năng gắn vào miền này.
Bảng 3.1. Các miền gắn thuốc trên kênh protein 3a SARS-CoV-2
Miền Dự đoán pKd cực đạia Dự đoán pKd trung bình Điểm gắn thuốcb Khả năng gắn thuốcc 1 11.85 6.68 -1004.00 Yếu 2 11.80 6.66 67.00 Trung bình 3 11.55 6.58 140.00 Trung bình 4 11.42 6.53 -430.00 Yếu 5 11.11 6.43 4166.00 Mạnh 6 10.94 6.37 2967.00 Mạnh 7 10.05 6.06 255.00 Trung bình 8 10.00 6.05 -300.00 Yếu 9 9.25 5.79 -808.00 Yếu 10 9.22 5.78 -326.00 Yếu 11 9.19 5.77 -395.00 Yếu 12 8.51 5.54 -980.00 Yếu 13 7.14 5.07 -882.00 Yếu
Chú thích: (a) giá trị pKd cực đại thể hiện hoạt tính của phối tử với thụ thể (giá trị dưới 6,0 gợi ý không có khả năng gắn thuốc). (b) điểm gắn thuốc do CavityPlus cung cấp có thể được sử dụng để phân biệt khả năng gắn thuốc giữa các miền trên protein. (c) mức độ gắn thuốc của một miền.
Chúng tôi tiếp tục sử dụng công cụ xác định túi hoạt động trong phần mềm ICM Pro để xác định các trung tâm tương tác với phối tử của vùng chứa khoang lớn và các đường hầm. Thu được hai trung tâm tương tác tạo bởi TM1 của tiểu đơn vị thứ nhất và TM2,3 của tiểu đơn vị thứ hai của protein. Các số liệu thu được từ hai trung tâm tương tác này tương đồng với nhau cho thấy cấu trúc protein 3a đối xứng giữa hai tiểu đơn vị (Bảng 3.2). Kết hợp các kết quả phân tích cấu trúc protein 3a SARS-CoV-2, xác định các axit amin từ vị trí 121 đến 129 là quan trọng với tương tác với phối tử.
26
Bảng 3.2. Thông số hai trung tâm tương tác với phối tử tại khoang lớn và các đường
hầm
Trung tâm tương tác Thể tích (Å3) Diện tích bề mặt (Å2) Tính kỵ nướca Độ sâub TM1B-TM2,3A 456.9 491.7 0.4363 0.6647 TM1A-TM2,3B 435.7 466.9 0.43 0.6669
Chú thích: (a) phần trăm diện tích bề mặt miền tương tác của các acid amin kỵ nước trên protein (giá trị nằm trong khoảng 0-1). (b) Tỉ số của diện tích bề mặt tiếp xúc môi trường bên trong protein và diện tích bề mặt tiếp xúc môi trường bên ngoài protein (giá trị thấp nhất có thể là 0,5 tức là miền tương tác hoàn toàn mở và bề mặt protein là phẳng; cao nhất là 1,0 tức là miền tương tác bị chôn vùi hoàn toàn bên trong protein).
3.2.Xây dựng cấu trúc phân tử mới