Bảng 3.7: Kết quả phẫu thuật tại cỏc thời điểm theo dừi
Thời điểm Sụ́ TT/tuổi 1 thỏng 2 thỏng 3 thỏng 6 thỏng 8 thỏng 1/29 Tốt Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90° Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90°, viờm trờn BMNC Tốt TL 2/10 Tốt TL 2/10 2/43 Tốt Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90° Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90°, viờm trờn BMNC Tốt TL 3/10 Tốt TL 3/10 3/13 Tốt Trung bỡnh, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 180° Trung bỡnh, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 180°, viờm trờn BMNC Trung bỡnh TL ĐNT 5m 4/03 Tốt Trung bỡnh, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 270° Trung bỡnh, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 270°, viờm trờn BMNC Trung bỡnh TL ĐNT3m Chưa tới thời điểm theo dừi 5/42 ĐNT 1m Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90° Trung bỡnh, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 180° Trung bỡnh ĐNT 5m 6/21 ĐNT 3m Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90° Tốt, tăng sinh tõn mạch vựng rỡa < 90° Tốt 4/10 Chưa tới thời điểm theo dừi
Qua quan sỏt mắt 6 bệnh nhõn sau phẫu thuật, biểu mụ bề mặt nhón cầu toàn vẹn, khụng cú tổn thương và được cải thiện một cỏch đỏng kể. Màng ối ỏp tốt lờn bề mặt lớp nhu mụ giỏc mạc, giỏc mạc trong, nhẵn búng, hiện tượng viờm đều được kiểm soỏt và khụng phỏt triển nặng lờn khi được
58
điều trị kịp thời tại cỏc thời điểm theo dừi tiếp theo. Hiện tượng tăng sinh tõn mạch qua vựng rỡa củng giỏc mạc dưới 90° thấy ở 4 mắt bệnh nhõn số 1/29, 2/43, và 6/21. 2 mắt bệnh nhõn số 3/1 , 4/03 và 5/42 ổn định, khụng cú biểu hiện thoỏi triển hoặc phỏt triển nặng lờn. Triệu chứng cộm chúi, chảy nước mắt, khú chịu đều giảm và mất đi sau phẫu thuật ở tất cả 6 bệnh nhõn. Thị
lực sau mổ tăng từ 1 đến 3 dũng so với thị lực trước phẫu thuật. Mắt của bệnh nhõn số 1 tại cỏc thời điểm đỏnh giỏ:
* Sau bỏng 3, 5 thỏng (Hỡnh 3.48)
Hỡnh 3.48: Mắt của bệnh nhõn số 1 sau bỏng 3, 5 thỏng
59 Hỡnh 3.49: Mắt của bệnh nhõn số 1 sau ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy 1 tuần, 2 thỏng. Hỡnh 3.50: Mắt của bệnh nhõn số 1 sau ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy 6 thỏng 2 thỏng 1 tuần 6 thỏng
60
Hỡnh 3.51: Mắt của bệnh nhõn số 1 sau ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy 8 thỏng
61
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Lựa chọn phương phỏp xử lý màng ối
Màng ối được sử dụng trong nhón khoa từ khỏ lõu do cỏc đặc điểm nổi trội của nú như: tớnh trong suốt, chun gión, mềm mại, mỏng, dai... đặc biệt tớnh hũa hợp mụ, ớt bị thải ghộp và khả năng chống viờm [20], [30], [33]. Mặt khỏc, đõy là một vật liệu sinh học rẻ tiền, dễ lấy, dễ xử lớ và bảo quản [11], [26], [32]. Nhiều tỏc giả trong và ngoài nước đó sử dụng màng ối để che phủ
bề mặt thương tổn của nhón cầu và đó khẳng định giỏ trị của nú [4], [25], [38]. Vựng màng ối được xử dụng làm nền nuụi cấy là khoảng 10 cm kể từ
rỡa bỏnh rau. Tại vựng này, chỳng tụi thấy màng ối dễ búc tỏch. Sau khi nạo bỏ biểu mụ, phần màng đỏy cũn lại trong suốt, phẳng, dai và chun gión tốt.
Trong nuụi cấy tế bào biểu mụ VRGM, rất nhiều tỏc giả đó sử dụng màng ối người làm nền nuụi cấy [23], [32], [38], [45]. Do tớnh chất của màng
ối gần giống như màng đỏy của biểu mụ giỏc mạc nờn tế bào biểu mụ giỏc mạc cú khả năng bỏm dớnh, phỏt triển, tăng sinh và di cư trờn nền màng ối. Mặt khỏc, tấm biểu mụ sau khi phỏt triển trờn nền màng ối thỡ dễ dàng được thu hoạch để cấy ghộp. Chỳng tụi thống nhất với nhận định của một số tỏc giả: Sử dụng màng ối tươi tốt hơn sử dụng màng ối sau bảo quản lạnh vỡ cỏc yếu tố sinh học trong màng ối tươi sẽ phỏt huy tỏc dụng trong quỏ trỡnh nuụi cấy. Tuy nhiờn, màng ối sau bảo quản lạnh vẫn được dựng phổ biến để làm nền nuụi cấy vỡ tớnh tiện lợi khi sử dụng [15], [26], [46].
Trong nghiờn cứu, chỳng tụi đó nuụi cấy mảnh VRGM trờn màng ối
được xử lý theo 3 phương phỏp: để nguyờn biểu mụ, loại bỏ biểu mụ bằng cơ
học, loại bỏ biểu mụ bằng ammonium 10% và nạo bỏ biểu mụ. Cỏc tế bào gốc vựng rỡa đó phỏt triển nhanh và tạo ra tấm biểu mụ đẹp trờn màng ối
62
4.2. Lựa chọn phương phỏp xử lý mảnh mụ vựng rỡa giỏc mạc
Việc trớch thủ mẫu mụ vựng rỡa đũi hỏi bỏc sĩ phẫu thuật phải cú hiểu biết sõu về cấu trỳc của nhón cầu và cú tay nghề cao. Theo Thoft R.A
(1989): vựng rỡa ở vị trớ từ 11h-1h là khu vực được xỏc định cú nhiều tế bào gốc giỏc mạc [43]. Kớch thước của mảnh vựng rỡa được trớch thủ dày khoảng 0,2 mm, rộng 1-1,5 mm, dài 2-3 mm trong nghiờn cứu của chỳng tụi cũng phự hợp với nhiều nghiờn cứu của cỏc tỏc giả khỏc [13], [45]. Việc lấy quỏ sõu xuống mụ nền sẽ làm tăng số lượng cỏc tế bào khụng mong muốn (cỏc nguyờn bào sợi và cỏc tế bào liờn kết khỏc) khi nuụi cấy. Mặt khỏc, mảnh mụ quỏ dầy sẽ khụng tạo điều kiện cho tế bào BMVR di cư sang nền màng ối. Trờn lõm sàng nhón khoa, việc lấy vựng rỡa càng nụng càng đỡ tổn hại đến nhón cầu bệnh nhõn. Với độ rộng mảnh mụ vựng rỡa sinh thiết, số lượng tế
bào gốc đủđể tạo tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy. Mặt khỏc diện sinh thiết nhỏ, phần vựng rỡa của mắt nhanh chúng được phục hồi. Điều này chỳng tụi
đó quan sỏt rừ trờn mắt thỏ và trờn mắt bệnh nhõn qua cỏc tiờu bản vi thể và cỏc tets nhuộm fluorescein. Nhận xột này của chỳng tụi cũng phự hợp với nhận xột của nhiều tỏc giả [40], [46], [50].
Việc nuụi cấy biểu mụ VRGM nhằm mục đớch tạo một tấm biểu mụ giỏc mạc với diện tớch đủ cho việc cấy ghộp từ một mảnh sinh thiết rất nhỏ
của vựng rỡa. Tế bào gốc của sự nhõn rộng đú nằm ở lớp đỏy của biểu mụ vựng rỡa (đó đề cập ở tổng quan). Việc xử lớ mẫu mụ vựng rỡa sinh thiết bằng enzym với hy vọng loại bỏ bớt cỏc tế bào lớp nụng của biểu mụ, tạo điều kiện cỏc tế bào gốc và tế bào giàu tiềm năng sinh sản, di cư phỏt triển tạo tấm biểu mụ trờn nền màng ối. Tuy nhiờn, ngoài tỏc dụng làm tỏch tế bào biểu mụ, cỏc enzym cũn là yếu tố gõy độc tế bào, thậm chớ gõy chết tế bào. Cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng 2 loại enzym là dispase (I hoặc II), trypsin và EDTA với cỏc nồng độ và thời gian khỏc nhau. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi đó sử dụng 3 cỏch xử lý mẫu mụ khỏc nhau đối với mẫu mụ vựng rỡa để
63
lựa chọn phương phỏp thớch hợp cho việc nuụi cấy tạo tấm biểu mụ giỏc mạc, đú là: mẫu mụ VRGM được xử lý bằng Dispase II nồng độ 2,4 UI/ml và EDTA 0,02%. Với cỏch xử lý này, cỏc tế bào gốc vựng rỡa phỏt triển nhanh và cho tấm biểu mụ đẹp.
4.3. Lựa chọn mụi trường nuụi cấy
Mụi trường nuụi cấy là một trong những yếu tố quyết định sự thành cụng của việc nuụi cấy. Việc sử dụng mụi trường nào để nuụi cấy tế bào gốc VRGM, hiện vẫn chưa cú sự thống nhất giữa cỏc tỏc giả. Tuy nhiờn, đa số
cỏc tỏc giả sử dụng mụi trường DMEM là mụi trường gốc để nuụi cấy tế bào gốcVRGM [39], [40], [50], [51]. Mụi trường DMEM được bổ sung cỏc thành phần khỏc nhau tựy từng tỏc giả. Trong đú huyết thanh FBS 10%, BS 10%, thậm chớ huyết thanh người cũng được một số tỏc giả sử dụng [14], [23], [45]. Trong giai đoạn đầu, chỳng tụi sử dụng mụi trường DMEM do Polivac cung cấp cú bổ sung 10% FBS, khỏng sinh, khỏng nấm và mụi trường DMEM cú bổ sung 10% BS, khỏng sinh, khỏng nấm để nuụi cấy tế bào gốc VRGM. Tuy nhiờn, kết quả thu được khụng khả quan. Trong mụi trường cú bổ sung BS, cỏc tế bào biểu mụ giỏc mạc phỏt triển chậm và khả năng bỏm dớnh vào màng ối khụng tốt. Cựng với sự phỏt triển chậm dần của tấm biểu mụ, xuất hiện sự thoỏi húa, chết tế bào của tấm biểu mụ đó mọc và sự tăng sinh nguyờn bào sợi. Hiện nay, mụi trường SHEM cú bổ sung: dimethyl sulfoxide, yếu tố tăng trưởng biểu mụ (Epithelial Growth Factor- EGF), FBS, insulin, hydrocortison, choleratoxin, tranferrin, khỏng sinh, khỏng nấm đang
được cỏc nhà nghiờn cứu sử dụng rộng rói để nuụi cấy tế bào gốc VRGM và tế bào biểu mụ niờm mạc miệng [18], [37].Trong nghiờn cứu của chỳng tụi cũng sử dụng mụi trường SHEM và bổ sung thờm EGF, FBS, insulin, penicilin, streptomycin, amphotericin, cỏc tế bào BMVRGM cũng phỏt triển tốt và tạo ra tấm biểu mụ đẹp.
64
4.4. Lựa chọn phương phỏp nuụi cấy
Qua quỏ trỡnh nghiờn cứu chỳng tụi nhận thấy phương phỏp nuụi tạo tấm biểu mụ giỏc mạc bằng mảnh mụ vựng rỡa cú những ưu điểm vượt trội hơn so với phương phỏp nuụi cấy bằng dịch treo. Mẫu mụ lấy nuụi cấy cú kớch thước nhỏ, phần vựng rỡa cũn lại nhanh chúng được hồi phục. Điều này rất cú ý nghĩa khi ỏp dụng trờn người. Với những bệnh nhõn tổn thương một mắt, chỳng tụi cú thể lấy mảnh mụ vựng rỡa ở mắt lành để nuụi tạo tấm biểu mụ và sẽ ghộp tự thõn cho bệnh nhõn. Trong khi đú, để thực hiện phương phỏp nuụi cấy bằng dịch treo cần sử dụng toàn bộ giỏc mạc của một bờn mắt thỏ. Như vậy, trờn người phương phỏp này sẽ chỉ thực hiện được với ghộp đồng loại. Hơn nữa, quy trỡnh xử lý mẫu của phương phỏp nuụi cấy bằng mảnh mụ rất đơn giản và khụng đũi hỏi trang thiết bị hiện đại như nuụi cấy bằng dịch treo. Thời gian nuụi tạo tấm biểu mụ từ
mảnh mụ vựng rỡa ngắn hơn. Cấu trỳc hỡnh thỏi vi thể, siờu vi thể, hoỏ học của tấm biểu mụ nuụi cấy giống với biểu mụ giỏc mạc. Hiện nay, trờn thế giới đa số
cỏc tỏc giả cũng sử dụng phương phỏp nuụi cấy bằng mảnh mụ để tạo tấm biểu mụ giỏc mạc [6], [8], [12], [24].
Chỳng tụi cũng đó tiến hành ghộp tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy cho thỏ
bị bỏng giỏc mạc. Kết quả là cỏc mảnh ghộp bỏm dớnh tốt và tồn tại trờn bề mặt nhón cầu, quỏ trỡnh biểu mụ hoỏ bề mặt nhón cầu diễn ra bỡnh thường, hạn chế được sự phỏt triển của tõn mạch từ bờn ngoài lan vào giỏc mạc. Trờn cơ sở đú, chỳng tụi đó ghộp tự thõn tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy cho 6 bệnh nhõn. Sau ghộp, bề mặt giỏc mạc đó được cải thiện rất nhiều, biểu mụ hoỏ hoàn toàn, giảm hẳn tỡnh trạng xơ mạch phỏt triển lan vào giỏc mạc. Cỏc bệnh nhõn này đang
được tiếp tục theo dừi đểđỏnh giỏ tuổi thọ của tấm biểu mụ nuụi cấy.
4.5. Về mụ hỡnh gõy bỏng giỏc mạc và ghộp tấm biểu mụ giỏc mạc nuụi cấy cho thỏ bị tổn thương giỏc mạc.
Bằng phương phỏp in dấu ấn NaOH 0,3% trong 7 giõy, chỳng tụi đó gõy bỏng giỏc mạc cho thỏ. Sau khi bị gõy bỏng, toàn bộ giỏc mạc và vựng rỡa trở nờn trắng đục. Những ngày sau đú, mắt bị sưng viờm, test fluorescein
65
(+) tớnh. Theo Lemp M.A.9 (1974) : Tổn thương của mụ mắt do bỏng kiềm nặng và cú xu hướng gõy biến chứng lõu dài sau tổn thương nguyờn phỏt. Chất kiềm kết hợp với lipit tạo hỡnh của tế bào tạo ra phức hợp hoà tan nờn dễ dàng xõm nhập vào mụ mắt [27]. Nhúm OH- của chất kiềm làm biến tớnh collagen, thuỷ phõn cỏc glycosaminoglycan (GAG), mucopolysacrid và gõy xà phũng hoỏ axit bộo của màng tế bào dẫn tới phỏ huỷ tế bào [29].Chất kiềm cũn cú tỏc động hỳt nước của tế bào, làm biến tớnh protein chức năng và làm thay đổi protein tạo hỡnh của tế bào. Điều này thể hiện rất rừ trờn cỏc tiờu bản vi thể mắt thỏ bị bỏng kiềm trong thực nghiệm của chỳng tụi: toàn bộ biểu mụ phủ giỏc mạc đó bị tổn thương bong mất, nhu mụ giỏc mạc trương phự theo thời gian . Đến ngày thứ 45 sau khi gõy bỏng, biểu mụ phủ
giỏc mạc vẫn chưa được khụi phục, chứng tỏ rằng vựng rỡa giỏc mạc đó bị
tổn thương hoàn toàn. Như vậy, mụ hỡnh gõy bỏng của chỳng tụi đó thành cụng. Sau khi tạo được sẹo giỏc mạc cho thỏ, chỳng tụi tiến hành trớch thủ
mảnh vựng rỡa ở mắt lành của thỏ để nuụi tạo tấm biểu mụ và ghộp cho mắt bỏng. Trong quỏ trỡnh gõy bỏng cũng như ghộp cho thỏ, theo chỳng tụi, khõu gõy mờ cho thỏđúng vai trũ quan trọng. Chỳng tụi chưa tỡm được tài liệu cho biết liều lượng dựng thuốc mờ cho thỏ. Thỏ rất dễ ngừng tim và chết do gõy mờ. Ngược lại, thỏ cũng rất nhanh tỉnh và gióy giụa nếu lượng thuốc mờ thấp . Điều này dễ gõy rỏch tấm biểu mụ và làm cuộc phẫu thuật thất bại.Sau ghộp, mắt của cỏc thỏ sưng viờm. Hiện tượng này giảm dần khi được điều trị
tớch cực. Trờn tiờu bản vi thể của mắt thỏ được ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy ở
tất cả cỏc thời điểm theo dừi, tấm biểu mụ luụn dỏn sỏt vào nhu mụ, bào tương và nhõn của cỏc tế bào biểu mụ bỡnh thường. Như vậy, cho đến thời
điểm 3 thỏng sau ghộp, tấm biểu mụ vẫn sống và hoà nhập vào mụ nền của giỏc mạc. Bước đầu cú thể núi rằng: phương phỏp nuụi cấy tế bào gốc VRGM và ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy trờn thực nghiệm đó thành cụng.
66
4.6. Ghộp tấm biểu mụ nuụi cấy cho bệnh nhõn tự nguyện
Qua nhiều năm nghiờn cứu, sự tồn tại và vai trũ của tế bào gốc của biểu mụ giỏc mạc đó được xỏc định rừ [6]. Hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mụ giỏc mạc là di chứng nặng nề ở giai đoạn mạn tớnh của bỏng mắt, gõy giảm sỳt thị lực trầm trọng. Biểu mụ BMNC, trong đú cú biểu mụ vựng rỡa củng giỏc mạc bị phỏ hủy do vụi, mất độ trong suốt và bị thay thế bởi tổ
chức xơ mạch hoặc khụng hàn gắn được sau chấn thương. Thị lực sẽ tổn hại nặng nề hơn nếu tổn thương sõu đến lớp chõn bỡ giỏc mạc. Mức độ nặng của bệnh, tiờn lượng điều trị, cũng như quyết định phương phỏp điều trị phụ
thuộc vào mức độ tổn thương của vựng rỡa củng giỏc mạc và mức độ viờm của BMNC. Đối với bệnh nhõn bị bỏng một mắt tiờn lượng điều trị tốt hơn vỡ cú thể tiến hành ghộp tự thõn. Theo nghiờn cứu T.K. Sõm năm 2001, ghộp kết mạc rỡa tự thõn từ mắt lành sang mắt cú suy giảm tế bào gốc sau bỏng mắt do húa chất cho kết quả tốt, tạo dải phõn cỏch ngăn chặn tổ chức xơ
mạch xõm lấn từ kết mạc lờn bề mặt giỏc mạc [5]. Nghiờn cứu trong nước và nước ngoài cũng chỉ rừ vai trũ của phẫu thuật ghộp màng ối đơn thuần là hỗ
trợ quỏ trỡnh biểu mụ húa BMNC, cải thiện vi mụi trường xung quanh tế bào gốc, kớch thớch sự tăng sinh và phỏt triển tỏi tạo tế bào biểu mụ [4, 5, 8, 12, 24]. Tuy nhiờn, nghiờn cứu cho thấy thời gian biểu mụ húa kộo dài từ 2 đến 3 tuần và cú thể khụng biểu mụ húa, gõy viờm loột sõu tới lớp nhu mụ giỏc mạc [6]. Nhiều nghiờn cứu đó chỉ rừ màng ối cú vai trũ quan trọng làm nền cho sự tăng sinh của cỏc tế bào biểu mụ và chỉ thời gian ngắn sau phẫu thuật màng ối cú thể kết dớnh chắc chắn với lớp nhu mụ giỏc mạc [3, 14, 23]. Do
đú, kỹ thuật nuụi cấy tế bào trờn nền màng ối, tạo tấm biểu mụ giỏc mạc từ
mảnh biểu mụ vựng rỡa giỏc củng mạc là phương phỏp mới, cú thể kết hợp cải thiện bề mặt nhón cầu trong thời gian ngắn, tiết kiệm tổ chức lành trờn