3.1.2.1. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối khụng nạo biểu mụ: Trờn lỏt cắt đứng dọc, màng ối gồm 3 lớp rừ: trờn cựng là biểu mụ vuụng đơn, dưới biểu mụ là màng đỏy mỏng, dưới màng đỏy là một lớp trung mụ vụ mạch và thuần nhất (Hỡnh3.4).
3.1.2.2. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học: Trờn lỏt cắt đứng dọc: màng ối gồm 3 lớp: lớp biểu mụ khụng rừ, thỉnh thoảng cũn sút một vài tế bào biểu mụ, màng đỏy và lớp trung mụ cú cấu trỳc rừ (Hỡnh 3.5). 3.1.2.3. Cấu trỳc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mụ bằng dung dịch Ammonium 10%: Màng ối rất mỏng, lớp biểu mụ và lớp trung mụ đó bị nạo bỏ toàn bộ, phần cũn lại chỉ là lớp màng đỏy hoặc cũn dớnh một số lỏ sợi collage nhỏ (Hỡnh 3.6) Hỡnh 3.4. Màng ối khụng nạo biểu mụ(H.E x 250) Hỡnh 3.5. Màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học(H.E x 250) Hỡnh 3.6. Màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium(H.E x 250)
38
Nuụi cấy tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn tấm màng ối khụng nạo biểu mụ và nạo biểu mụ bằng cơ học: hầu hết cỏc mẫu nuụi cấy khụng mọc. Một vài mẫu mọc nhưng rất chậm. Sau 2-3 tuần, tấm biểu mụ chưa cú cấu trỳc điển hỡnh của biểu mụ giỏc mạc, chỉ gồm 2-3 hàng tế bào dẹt. Sự phỏt triển của cỏc tế bào biểu mụ khụng liờn tục, tấm biểu mụ cú những chỗ trống (Hỡnh 3.7, 3.8). Hỡnh 3.7. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối cũn biểu mụ (Giemsa x200) Hỡnh 3.8. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối nạo biểu mụ bằng cơ học (Giemsa x200) Hỡnh 3.9. Tấm biểu mụ nuụi trờn màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium (Giemsa x200)
Nuụi cấy tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn tấm màng ối nạo biểu mụ bằng Ammonium 10%: Khi nuụi tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc trờn màng ối tươi và màng ối ró đụng, cỏc tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc phỏt triển nhanh.
Đến ngày thứ 10 cỏc tế bào đó lan kớn đỏy của lồng nuụi cấy. Sau 2- 3 tuần, từ một mảnh mụ cú kớch thước 1mm x 1mm, cỏc tế bào gốc vựng rỡa đó tạo thành một tấm biểu mụ cú diện tớch 4cm2. Tấm biểu mụ là một biểu mụ lỏt tầng khụng sừng hoỏ gồm 4-5 hàng tế bào (Hỡnh 3.9). Những tấm biểu mụ này đó được ghộp cho thỏ và người bị bỏng. Kết quả ghộp rất khả quan.
Kết luận: Chọn phương phỏp xử lý màng ối bằng ammonium 10% và nạo biểu mụ nhẹ nhàng bằng cỏi nạo biểu mụ, qui trỡnh gồm cỏc bước sau:
1. Cỏc tấm màng ối kớch thước 3 x 3 cm được rửa trong DMSO với cỏc nồng độ khỏc nhau.
39
2. Rửa bằng PBS.
3. Ngõm trong Ammonium 10%. 4. Nạo bỏ lớp biểu mụ và trung mụ. 5. Rửa lại bằng PBS.
6. Bảo quản màng ối đó xử lý trong dung dịch DMSO 15% ở nhiệt độ -800 C (sử dụng trong 6 thỏng).
7. Khi sử dụng, ró đụng ở nhiệt độ phũng, rửa lại bằng PBS. 8. Căng màng ối lờn phiến hoặc lồng nuụi cấy.