a. Phương pháp tách chiết mẫu.
Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là sản phẩm dinh dưỡng có nền mẫu phức tạp. Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện.
Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết mẫu [6][15][22].
Chiết pha rắn là một phương pháp chuẩn bị để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng dung môi thích hợp, các chất ảnh hưởng được loại bỏ.
Các bước của quá trình chiết pha rắn được mô tả như sau [3]:
Hình 2.1:Các bước của quá trình chiết pha rắn
1. Hoạt hóa chất hấp phụ và pha rắn.
Làm ướt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ.
Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp hấp phụ.
Không được để chất hấp phụ bị khô.
2. Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột
Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ.
Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thể bị giữ lại.
Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra. 3. Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột.
Nếu mẫu là dung dịch nước, sử dụng hệ đệm hoặc hồn hợp nước-dung môi hữu cơ để rửa tạp.
Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi đó.
4. Rửa giải
Dung môi được chọn phải phá vỡ dễ dàng tương tác giữa chất phân tích và chất
hấp phụ.
Thể tích dung môi rửa giải càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo rửa sạch chất phân tích ra khỏi vật liệu hấp phụ.
Chất hấp phụ chiết pha rắn thường sử dụng gồm các loại:
Chất hấp phụ pha thường: Các silica trung tính, oxit nhôm.
Chất hấp phụ pha ngược: Các silica đã được ankyl hóa nhóm –OH.
Chất có khả năng trao đổi ion.
Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước.
Chất hấp phụ pha khí-rắn.
Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến do những ưu điểm vượt trội sau:
Hiệu suất thu hồi cao.
Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích dễ dàng.
Giảm lượng dung môi sử dụng.
Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích.
An toàn, đơn giản và có thể tiến hành hàng loạt.
b. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Chúng tôi lựa chọn phương pháp phân tích là sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS/MS) để xác định bufalin trong sản phẩm dinh dưỡng có thành phần làm từ cóc. Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4). Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3. LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10.
Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đường nền
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích.
Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định khoảng tuyến tính người ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích.
Độ lặp lại và độ thu hồi.
Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay hệ số biến thiên CV(%):
1 1 2 N x x S N i i Trong đó:
xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i
x: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm.
Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi (recovery). Độ thu hồi (đánh giá độ đúng) là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết.
R(%) = C
Cc x100% Trong đó:
R: độ thu hồi (%)
C (Ctt) : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml). Cc (Clt) : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/ml).
d. Phương pháp xử lý số liệu.
Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex). Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN