3.1.2.1. Pha tĩnh.
Trong nghiên cứu này, qua tham khảo các tài liệu [16][24] [26], chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để phân tích Bufalin. Đây là loại pha tĩnh phổ biến, phù hợp các điều kiện của phòng thí nghiệm. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột:
Tiền cột C18 (4 mm x 4,6 mm x 5 µm).
3.1.2.2. Pha động
a. Lựa chọn thành phần pha động
Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic… Dùng dung dịch chuẩn bufalin 500 ng/ml để khảo sát dung môi pha động. Hơn nữa để có thể vừa tách được bufalin, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient. Các điều kiện chạy máy được cố định như sau:
Cột: Symmetry water C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm).
Tiền cột C18 (4 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Detector khối phổ với các thông số ở bảng 3.2.
Pha động: lần lượt sử dụng các hỗn hợp acetonitrile – acid formic 0,1 %; acetonitril – acid acetic 0,1% và acetonitril – amoni acetat 0,1 % theo chương trình gradient dưới đây:
Thời gian (phút)
Tỷ lệ (%)
Acetonitril Acid formic (hoặc acid acetic,
amoni acetat) 0,1% 1,00 20 80 4,00 80 20 7,00 80 20 7,01 20 80 10,00 20 80 Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Sử dụng dung dịch chuẩn ở nồng độ 500 ng/ml.
Kết quả thời gian lưu và diện tích pic của bufalin thu được khi thay đổi thành phần pha động được tập hợp ở bảng 3.3 (sắc ký đồ ở phụ lục 3.1).
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic bufalin
Thành phần pha động TR (min) Spic
ACN - CH3COOH 0,1% 7.45 58500
ACN - HCOOH 0,1% 7.43 85400
ACN -CH3COONH4 0,1% 7.44 44100
Hình 3.1: Sắc ký đồ của dung dịch bufalin chuẩn với pha động ACN - HCOOH 0,1% Nhận xét: Sử dụng pha động là acetonitril - acid formic 0,1% cho diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phép đo khi phân tích bufalin, pic bufalin cân đối, không bị chẻ, doãng chân pic. Do đó chúng tôi chọn pha động acetonitril - dung dịch acid formic 0,1 % cho những khảo sát tiếp theo.
b. Lựa chọn chương trình chạy gradient
Để có thể vừa tách các chất vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient. Tiến hành khảo sát ở các chương trình chạy gradient khác nhau với tốc độ dòng 1 ml/phút (bảng 3.4). Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 và sắc ký đồ phụ lục 3.2.
Bảng 3.4: Khảo sát các chương trình chạy gradient
STT Thời gian
(phút)
Tỷ lệ (%) thành phần pha động
Acid formic 0,1% Acetonitril
1 1,00 80 20 4,00 20 80 7,00 20 80 7,01 80 20 10,00 80 20 2 1,00 40 60 4,00 60 40 10,00 60 40 10,01 40 60 13,00 40 60 3 1,00 20 80 4,00 80 20 10,00 80 20 10,01 20 80 16,00 20 80 4 1,00 90 10 4,00 10 90 10,00 10 90
Gradient Kết quả 10,01 90 10 14,00 90 10 5 1,00 60 40 4,00 40 60 7,00 40 60 7,01 60 40 10,00 60 40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát gradient
1 2 3 4 5
Diện tích pic 529 000 517 000 219 000 345 000 271 000
Chiều cao pic 100 000 20 300 40 900 99 800 58 500
Nhận xét: Sau quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy chương trình gradient 1 cho đáp ứng pic của bufalin có cường độ lớn nhất, pic cân xứng, không bị chẻ pic. Và chương trình gradient này được lựa chọn để thiết lập phương pháp phân tích bufalin.
c. Khảo sát tốc độ dòng pha động.
Thời gian lưu và hình dạng của pic sắc ký phụ thuộc nhiều vào tốc độ dòng pha động. Nếu tốc độ dòng pha động lớn, cũng có nghĩa thể tích pha động lớn, khả năng phân bố các chất trong pha động lớn. Nếu là hỗn hợp nhiều chất sẽ ra nhanh và gây chồng lấp các pic. Nhưng nếu tốc độ quá chậm thì chất phân tích bị giữ lại trong cột lâu, thời gian phân tích kéo dài, ảnh hưởng đến hình dạng của pic (pic bị kéo đuôi, tù), phân tích kém chính xác. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động ở 3 tốc độ: 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 và sắc ký đồ phụ lục 3.3.
Bảng 3.6: Khảo sát tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng (ml/phút) 0,8 1,0 1,2
Diện tích pic 94700 271000 106000
Chiều cao pic 17100 58500 24300
Thời gian lưu (phút) 6,78 7,45 8,42
Nhận xét: kết quả ở bảng trên cho thấy ở tốc độ dòng pha động 1 ml/phút cho diện tích pic và chiều cao pic lớn nhất, do đó chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng pha động ở 1 ml/phút.
Như vậy, qua quá trình khảo sát thực nghiệm, chúng tôi thiết lập quy trình phân tích bufalin với các điều kiện sắc ký như sau:
Cột: Symmetry water C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm).
Tiền cột C18 (4 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Pha động: Dung dịch acid formic 0,1% - acetonitril.
Chương trình gradient dung môi (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Chương trình gradient tối ưu
Thời gian (phút) Tốc độ dòng
(ml/phút)
Tỷ lệ (%) thành phần pha động
Acid formic 0,1 % Acetonitril
1,00 1 80 20
4,00 1 20 80
7,00 1 20 80
7,01 1 80 20
10,00 1 80 20
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hai quy trình xử lý mẫu dưới đây được đánh giá sơ bộ để lựa chọn: Quy trình 1 [22]:
Cân chính xác khoảng 1g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm, thêm 10 ml methanol lắc votex 1 phút, đồng nhất. Sau đó ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, cô quay ở 400C, hòa cắn bằng 1ml MeOH, pha loãng bằng 10 ml nước, chuyển sang ống ly tâm, ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Lọc qua giấy lọc, rồi cho qua cột HLB. Cột được hoạt hóa bằng 1 ml MeOH, 1ml H2O; mẫu được
nạp sau khi hoạt hóa. Cột được rửa bằng 1ml dung dịch CH3COOH 2% trong MeOH -
H2O (50 : 50) và 1 ml dung dịch NH4OH trong MeOH - H2O (50:50). Rửa giải bufalin bằng 1 ml CH3COOH 0,5% trong MeOH. Lấy dịch rửa giải đem phân tích.
Quy trình 2 [27]:
Cân chính xác khoảng 1g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm, thêm 10 ml MeOH lắc votex 1 phút, đồng nhất, sau đó ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, cô quay 400C, hòa cắn bằng 1ml MeOH, lọc qua màng 0,22 µm lấy dịch đem phân tích.
Nhằm mục đích tìm ra quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 2 quy trình xử lý mẫu đã nêu ở trên. Cân chính xác khoảng 1g mẫu bột đạm cóc đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml, thêm 100 µl dung dịch chuẩn nồng độ 5 µg/ml vào mỗi ống mẫu như vậy dịch cuối thu được sẽ có nồng độ 500 ng/ml, tiến hành xử lý mẫu theo 2 quy trình trên. Mỗi quy trình tiến hành làm lại 2 lần lấy kết quả trung bình. Kết quả được chỉ ra ở bảng sau:
+1 ml MeOH +1ml H2O
+ 10 ml H2O
Hoạt hóa
Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Kết quả Quy trình 1 Quy trình 2
Clt (ng/ml) 500 500
Ctt (ng/ml) 480 170
R(%) 96 34
Nhận xét: Từ kết quả thu được ta nhận thấy quy trình 1 cho hiệu suất thu hồi tốt nhất. Do đó trong khóa luận này chúng tôi sẽ tập trung khảo sát các điều kiện của quy trình 1 để đưa ra một quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất.
Hình 3.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Rửa tạp
+ 10 ml MeOH
Gạn dịch vào bình cô, cô quay ở 400C
Hòa cắn bằng 1ml MeOH
Lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc
Cột HLB đã hoạt hóa
Cột
Rửa giải 1 ml CH3COOH 0,5% trong MeOH
Lắc votex 1 phút; Ly tâm 5 phút, 6000 vòng/phút Cân 1g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Chuyển sang ống ly tâm, ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút Vial, LC-MS/MS +1 ml CH3COOH 2% trong MeOH-H2O (50:50,v/v) +1 ml NH4OH 2% trong MeOH-H2O (50:50, v/v)
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết
Dung môi chiết là một yếu tố vô cùng quan trọng quyết định hiệu suất của quá trình xử lý mẫu. Cân chính xác khoảng 1g bột đạm cóc (không chứa bufalin) vào các ống ly tâm 50 ml, thêm chuẩn bufalin nồng độ 250 ng/ml, tiến hành làm theo quy trình 1. Qua tham khảo một số tài liệu [20][25] …, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 5 loại dung môi chiết là methanol, ethanol, ethyl acetate, cloroform, acetonitril. Kết quả thể hiện ở bảng 3.9:
Bảng 3.9: Khảo sát dung môi chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung môi Methanol Ethanol Ethyl
acetate Cloroform Acetonitril
Diện tích
pic 45000 40800 33800 214 36300
Nhận xét: Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn methanol làm dung môi chiết.
3.2.3. Khảo sát thể tích chiết
Chiết mẫu không chứa bufalin được thêm chuẩn ở nồng độ 250 ng/ml bằng dung môi methanol 1 lần, 2 lần, mỗi lần bằng 5 ml methanol và 10 ml methanol. Các bước được tiến hành theo quy trình 1. Ta thu được kết quả bảng 3.10 và sắc ký đồ phụ lục 3.5.
Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết
Lần chiết Clt (ng/ml) Kết quả V=5 ml V=10 ml
1 250 Ctt (ng/ml) 85,8 111,3
R (%) 34,3 44,5
2 250 Ctt (ng/ml) 102,8 200,0
Nhận xét: Qua quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy chiết 1 lần thì chất phân tích vẫn chưa hoàn toàn được chiết lên dung môi. Kết quả chiết 2 lần, mỗi lần bằng 10 ml methanol cho hiệu suất thu hồi cao nhất là 80% là chấp nhận được do đó chúng tôi chọn chiết 2 lần mỗi lần bằng 10 ml methanol.
3.2.4. Khảo sát cột chiết
Vì bufalin có tính phân cực trung bình [13] nên chúng tôi chọn 2 loại cột để khảo sát là cột C18 [15] và cột polydivinylbenzen-N-vinylpyrolidon HLB Oasis (hydrophile lyophile balance) [6][22] . Để khảo sát ta tiến hành như sau: Đối với cột HLB làm như quy trình 1, chiết mẫu 2 lần mỗi lần 10 ml methanol. Đối với cột C18 giai đoạn chiết mẫu làm tương tự như với cột HLB. Giai đoạn qua cột, hoạt hóa cột bằng 3 ml MeOH và 3 ml nước; rửa tạp bằng 3 ml dung dịch MeOH-H2O (20:80); rửa giải bằng 3ml dung dịch MeOH-H2O (80:20); Thổi khô dịch rửa giải, hòa cắn bằng 1 ml MeOH đem phân tích. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.11 và sắc ký đồ phụ lục 3.6.
Bảng 3.11: Khảo sát cột chiết pha rắn
Cột Clt (ng/ml) Ctt (ng/ml) R (%)
C18 250 100 40
HLB 250 208 83.1
Nhận xét: Kết quả chỉ ra rằng đối với bufalin thì việc sử dụng cột chiết pha rắn HLB®Oasis tốt hơn so với cột C18.
3.2.5. Khảo sát dung dịch rửa giải.
Trong quá trình rửa giải, nồng độ acid acetic trong dung dịch rửa giải ảnh hưởng tới lực đẩy chất phân tích ra khỏi cột. Vì bufalin có tính base yếu nên dung dịch rửa giải phải có tính acid để đẩy chất phân tích, đồng thời dung môi MeOH có tách dụng lôi kéo chất phân tích ra khỏi cột. Tuy nhiên dung dịch đó cũng không được quá acid,
vì sẽ gây phân hủy chất phân tích. Do đó cần phải tìm được nồng độ acid acetic phù hợp với loại cột và chất phân tích. Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 1, sau đó rửa giải bằng các dung dịch methanol, acid acetic 0,1%, acid acetic 0,5%, acid acetic 1% trong methanol. Kết quả thu được chỉ ra ở bảng 3.12:
Bảng 3.12: Khảo sát dung dịch rửa giải
Dung dịch rửa giải Clt (ng) Ctt (ng) R (%)
Methanol 250 96,8 38,7
0,1% CH3COOH trong methanol 250 216,8 86,7
0,5% CH3COOH trong methanol 250 156,3 62,5
1% CH3COOH trong methanol 250 82,8 33,1
Nhận xét: Kết quả cho thấy dung dịch rửa giải acid acetic 0,1% cho hiệu suất thu hồi cao nhất do đó chúng tôi chọn dung dịch acid acetic 0,1% trong methanol làm dung dịch rửa giải. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.6. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải.
Thể tích dung dịch rửa giải ảnh hưởng lớn đến kết quả chiết mẫu của quy trình xử lý mẫu. Lượng dung dịch rửa giải phải đủ lớn để chất phân tích có thể được rửa giải ra khỏi cột hoàn toàn. Nhưng nếu lượng đó quá lớn cũng ảnh hưởng không tốt đến kết quả vì nếu thể tích lớn sẽ dẫn đến hàm lượng nước chứa trên cột quá lớn, gây ảnh hưởng không tốt đến kết quả vì thể tích lớn hàm lượng dung môi chứa trên cột lớn, gây ảnh hưởng quá trình trao đổi ion của cột.
Cân chính xác khoảng 1g mẫu bột đạm cóc (không chứa bufalin) đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml, thêm chuẩn bufalin ở nồng độ 250 ng/ml, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình, khảo sát tại các thể tích rửa giải khác nhau là: 1, 2, 3 ml dung dịch acid acetic 0,1% trong methanol. Ta thu được kết quả (bảng 3.13):
Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích dung dịch rửa giải
Thể tích rửa giải (ml) 1 2 3
Clt (ng/ml) 250 250 250
Ctt (ng/ml) 209,8 153 154
Độ thu hồi R (%) 83.9 61,2 61,7
Nhận xét: Theo kết quả bảng trên chúng tôi chọn thể tích dung dịch rửa giải là 1 ml dung dịch acid acetic 0,1% trong methanol cho các thí nghiệm tiếp theo.
+1 ml MeOH +1ml H2O
Hình 3.3: Quy trình xử lý mẫu tối ưu
3.3. Thẩm định phương pháp.
3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc.
Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký lỏng khối phổ chúng tôi sử dụng các phương pháp xác nhận (confirmation method). Theo hội đồng Châu Âu điểm
+ 10 ml H2O
+1 ml CH3COOH 2% trong MeOH-H2O (50:50)
+1 ml NH4OH 2% trong MeOH-H2O (50:50)
+ 10 ml methanol
Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút
Gạn dịch vào bình cô, cô quay ở 400C
Hòa cắn bằng 1ml MeOH
Lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc
Cột HLB đã hoạt hóa Cột HLB
Rửa giải 1 ml CH3COOH 0,1% trong MeOH
Vial, LC-MS/MS Lắc votex 1 phút
Cân 1g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Chuyển sang ống ly tâm, ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút
Bã
IP (điểm nhận dạng- identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.
Bảng 3.14: Ion mẹ và 2 ion con của bufalin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ion mẹ Ion con Số điểm IP
387 351 4
255
Như vậy phương pháp đáp ứng được yêu cầu. Hơn nữa để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/chọn lọc phù hợp, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng. Kết quả cho thấy mẫu trắng không cho các mảnh m/z của chất phân tích. Sự có mặt của các mảnh cho phép định tính, định lượng bufalin một cách đặc hiệu.
Hình 3.4: Sắc đồ mẫu trắng
Hình 3.6: Sắc đồ mẫu bột đạm cóc phát hiện có bufalin
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).
Để xác định LOD, LOQ chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn 100 ng/ml của bufalin và phân tích cho đến khi không còn đáp ứng. Chúng tôi xác định được ở nồng độ 1,25 ng/ml đáp ứng pic của bufalin gấp 3 lần độ nhiễu đường nền do đó chúng tôi xác định được LOD=1,25 ng/ml. Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ=3,33LOD. Vậy LOQ=4,16 ng/ml.
Hình 3.7: Sắc đồ bufalin tại LOD
Nhận xét: Chúng tôi sử dụng phương pháp xác định trực tiếp LOD, LOQ dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) [5]. Giới hạn phát hiện của bufalin là 1,25 ng/ml.
3.3.3. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn.
Chúng tôi đã khảo sát quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ bufalin trong khoảng nồng độ từ 10 – 1000 ng/ml. Kết quả phân tích thu được được tập hợp trong bảng 3.15.
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của bufalin
Nồng độ
(ng/ml) 10 20,0 50,0 100,0 200,0 500,0 1000,0
Diện tích
pic 26732 51500 78300 111000 214000 462000 899000
Hình 3.8: Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chuẩn bufalin
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ 10,0-1000,0 ng/ml có quan hệ chặt chẽ giữa nồng độ bufalin và đáp ứng pic trên sắc ký đồ.