Chúng tôi đã khảo sát quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ bufalin trong khoảng nồng độ từ 10 – 1000 ng/ml. Kết quả phân tích thu được được tập hợp trong bảng 3.15.
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của bufalin
Nồng độ
(ng/ml) 10 20,0 50,0 100,0 200,0 500,0 1000,0
Diện tích
pic 26732 51500 78300 111000 214000 462000 899000
Hình 3.8: Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chuẩn bufalin
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ 10,0-1000,0 ng/ml có quan hệ chặt chẽ giữa nồng độ bufalin và đáp ứng pic trên sắc ký đồ.
3.3.4.Độ lặp lại
Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích độc lập 6 lần trên mẫu bột Royal Baby (đã xác định sơ bộ có bufalin). Độ lặp lại được thể hiện qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng bufalin tính được từ 6 lần phân tích kể trên (bảng 3.16).
Bảng 3.16: Kết quả đánh giá độ lặp lại
Lần phân tích Lượng cân mẫu
(g) Diện tích pic bufalin Nồng độ bufalin trong dung dịch thử (ng/ml) Hàm lượng bufalin trong mẫu (ng/g) 1 1,1503 43878 16,4 14,3 2 1,0226 43443 15,9 15,5 3 1,0207 42051 14,3 14,0 4 1,1652 44226 16,8 14,4 5 1,0671 42225 14,5 13,6 6 1,1255 43617 16,1 14,3 TB 14,3 RSD (%) 4,6
Kết quả thực nghiệm cho thấy, RSD (%) sau 6 lần phân tích độc lập chỉ là 4,6 % trong khi hàm lượng bufalin tìm được trong mẫu ở vùng thấp hơn 20 ng/ml. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại tốt khi áp dụng định lượng bufalin ở dạng vết trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng có nguồn gốc từ cóc.
3.3.5. Độ đúng
Để đánh giá độ đúng, bufalin chuẩn được thêm vào nền dung dịch mẫu thử bột đạm cóc ở các mức nồng độ 10, 50, 100 ng/ml, mỗi mức tiến hành độc lập 3 lần. Các mẫu thêm chuẩn được phân tích và tính toán độ thu hồi (%) của chuẩn bufalin so với nồng độ thêm vào. Kết quả phân tích được trình bày trong (bảng 3.17).
Độ thu hồi của bufalin tại 3 mức nồng độ khảo sát nằm trong khoảng 80,0 – 88,2%, nghĩa là bên trong khoảng thu hồi 80 -110% theo quy định của hội đồng châu Âu [5]. Do đó phương pháp này có độ đúng tốt khi phân tích bufalin trong sản phẩm dinh dưỡng từ cóc.
Bảng 3.17:Kết quả đánh giá độ đúng
Nồng độ bufalin chuẩn
thêm vào (ng/ml)
Lượng cân mẫu (g) Diện tích pic bufalin Nồng độ bufalin chuẩn tìm lại được (ng/ml) Tỷ lệ tìm lại (%) 10,0 1,1351 50763 8,0 80,0 10,0 1,0267 49697 8,4 84,0 10,0 1,1566 51119 8,1 81,0 50,0 1,0023 79408 42,9 85,8 50,0 1,0578 79536 42,2 84,4 50,0 1,0770 78992 41,3 82,6 100,0 1,1422 119219 86,6 86,6 100,0 1,1087 119584 87,5 87,5 100,0 1,0761 119786 88,2 88,2 3.3.6. Bàn luận
Kết quả thẩm định về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện cho thấy:
- Về mặt định danh, phương pháp cho phép phát hiện một cách đặc hiệu sự có mặt của bufalin trong sản phẩm dinh dưỡng từ cóc với giới hạn phát hiện nhạy (1,25 ng/ml tính theo nồng độ dung dịch tiêm sắc ký, nghĩa là tương đương với 1,25 ng/g trong mẫu phân tích khi áp dụng quy trình xử lý mẫu đã xây dựng)
- Về mặt định lượng, phương pháp cho phép xác định bufalin với độ đúng (tỷ lệ thu hồi trên 80% khi đánh giá ở mức nồng độ chuẩn thêm vào 100 ng/ml), độ lặp lại (RSD = 4,6% khi phân tích 6 lần độc lập trên mẫu có hàm lượng bufalin dưới 20 ng/ml) tốt và giới hạn định lượng thấp (4,16 ng/ml tính theo nồng độ dung dịch tiêm sắc ký, nghĩa là tương đương với 4,16 ng/g trong mẫu phân tích khi áp dụng quy trình xử lý mẫu đã xây dựng). Như vậy phương pháp được thiết lập trong nghiên cứu này phù hợp để áp dụng xác định bufalin trong các sản phẩm dinh dưỡng làm từ cóc.
3.4. Phân tích mẫu thực tế
Do điều kiện thời gian có hạn, trong khuôn khổ nghiên cứu này, phương pháp phân tích bufalin đã được ứng dụng để đánh giá 2 sản phẩm dinh dưỡng có nguồn gốc từ cóc sản xuất trong nước (bảng 2.1).
Kết quả phân tích cho thấy trong cả hai mẫu đều phát hiện có mặt bufalin ở hàm lượng lần lượt là 14,3 và 19,0 ng/g (bảng 3.18).
Bảng 3.18: Kết quả phân tích bufalin trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc
Mẫu Hàm lượng bufalin (ng/g)
Bột cóc Royal baby 14,3
Bột đạm cóc 19,0
Với LD50=2,35 mg/kg thì hàm lượng bufalin có trong 2 mẫu trên rất nhỏ, khả năng gây độc rất thấp.
Như vậy, chỉ mới qua kiểm tra trên 2 mẫu sản phẩm dinh dưỡng có thành phần nguyên liệu từ cóc, có thể thấy nguy cơ nhiễm bufalin trong các sản phẩm này là rất thực tế. Tuy nhiên, với số mẫu phân tích còn hạn chế, khuôn khổ nghiên cứu này chưa thể đưa ra được một đánh giá xác thực về nguy cơ tổng thể nhiễm bufalin trong sản phẩm dinh dưỡng. Chính vì vậy, một nhu cầu cấp thiết mang tính thực tế cao là cần mở rộng kiểm tra bufalin trên nhiều đối tượng sản phẩm dinh dưỡng có nguyên liệu từ cóc để đánh giá chính xác nguy cơ, mức độ nhiễm bufalin trong nhóm sản phẩm này, từ đó đưa ra các quy định quản lý phù hợp để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định bufalin trong một số thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu được các kết quả sau.
1. Đã tối ưu hóa các điều kiện khối phổ để xác định bufalin.
Khảo sát tìm được ion mẹ của bufalin m/z=387, ion con định tính m/z=255, ion con định lượng m/z=351.
Tìm các điều kiện tối ưu khối phổ.
Thông số IS (V) TEM (oC) GS1 (psi) GS2 (psi) CUR (psi) DP (V) EP (V) CAD (psi) CXP (V) Giá trị tối ưu 5500 450 40 25 25 150 12 9 12
2. Đã tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Pha tĩnh:
Cột: Symmetry water C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Tiền cột C18 (4 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Pha động:
Là hệ dung môi gồm 2 kênh, kênh A: acid formic 0,1% và kênh B acetonitril, tìm được chương trình chạy gradient tối ưu.
Tốc độ dòng 1ml/phút.
3. Đã khảo sát quy trình xử lý mẫu.
Chúng tôi đã khảo sát và đưa ra quy trình xử lý mẫu tối ưu.
4. Thẩm định phương pháp: Phương pháp có độ nhạy tốt với LOD là 1,25 ng/ml, độ thu hồi đạt yêu cầu trong khoảng 80-110% và độ lặp lại đạt yêu cầu CV% < 15%. 5. Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế: Áp dụng phương pháp để phân tích 2 mẫu thực phẩm chức năng bột đạm cóc (Viện Dinh Dưỡng), bột cóc royal baby (Công ty CP Công nghệ và Hóa sinh Hà Nội) cho thấy cả 2 mẫu đều có bufalin và theo tìm hiểu của chúng tôi, hiện nay chưa có quy định nào về mức giới hạn hàm lượng bufalin trong thực phẩm.
Kiến nghị
1. Tiến hành áp dụng phương pháp thu được đối với các cơ sở chế biến, sản xuất các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc nhằm tránh các trường hợp ngộ độc do bufalin.
2. Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm các chất khác trong nhóm bufadienolide trong sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
[1] Trần Minh Hoàng (2010), Làm gì để ngăn chặn những cái chết thương tâm do Cóc,
Thông Tin - Truyền Thông ATTP, Sở y tế Bình Dương.
[2] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học. [3] Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Thanh Bình (2012), Tiểu luận đại cương chiết pha rắn và ứng dụng chiết pha rắn.
[4] Nguyễn Văn Ri (2004), Giáo trình các phương pháp tách, ĐH Quốc Gia Hà Nội. [5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
TIẾNG ANH
[6] Cao Y., Zhao L., Liang Q., Bi K., Wang Y., Luo G. (2007), "Study of the determination and pharmacokinetics of bufadienolides in dog’s plasma after administration of Liu-Shen-Wan by high performance liquid chromatography time-of- flight mass spectrometry", Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 853, 227–233.
[7] Gao H., Zehl M., Leitner A., Wu X., Wang Z., Kopp B. (2010), "Comparison of toad venoms from different Bufo species by HPLC and LC-DAD-MS/MS", J Ethnopharmacol, 131, 368–376.
[8] Gao F. và cộng sự (2014), "Recent developments in the field of the determination of constituents of TCMs in body fluids of animals and human", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 87, 241–260.
[9] Huang H., Liang M., Luo H., Zhang W., (2009), "Simultaneous Determination of Bufadienolides and Qualitative Evaluation for Venenum Bufonis by High Performance Liquid Chromatography", Chemical Research in Chinese Universities, 25, 801–806. [10] Hu Y., Yu Z., Yang ZJ., Zhu G., Fong W., (2011), "Comprehensive chemical analysis of Venenum Bufonis by using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 56, 210–220.
[11] Kamboj A., Rathour A., Kaur M., (2013) "bufadienolides and their medicinal utility: a review", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5, 20-27.
[12] Krenn L., Kopp B., (1998), "Bufadienolides from animal and plant sources",
Phytochemistry, 48, 1–29.
[13] Lee H., Koung F., Kwon K., Kang D., Cohen L., Yang P., (2012), "Comparative Analysis of the Bufonis Venenum by Using TLC, HPLC, and LC-MS for Different Extraction Methods", J Pharmacopuncture, 15, 52–65.
[14] Li J., Zhang Y. Lin Y., Wang X., Fang L., Geng Y., (2013), "Preparative separation and purification of bufadienolides from ChanSu by high-speed counter- current chromatography combined with preparative HPLC", Química Nova, 36, 686– 690.
[15] Liang Y., Liu A., Qin S., Sun J., Yang M., Li P., (2008), "Simultaneous determination and pharmacokinetics of five bufadienolides in rat plasma after oral administration of Chansu extract by SPE-HPLC method", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 46, 442–448.
[16] Liu J., Wang J., Yu B., (2008), "Determination of three bufogenins in toad venom using reversed-phase high performance liquid chromatography", Chinese journal of chromatography, 26, 186–188.
[17] Oda M., Kurosawa M., Numazawa S., Tanaka S., Akizawa T., Ito K., (2001), "Determination of bufalin-like immunoreactivity in serum of humans and rats by time- resolved fluoroimmunoassay for using a monoclonal antibody", Life Sci, 68, 1107– 1117.
[18] R.E. Ardrey, (2003), Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction, New York, J. Wiley.
[19] Santa Cruz Biotech, Bufalin | CAS 465-21-4 |
http://www.scbt.com/datasheet-200136-bufalin.html .
[20] Sun Y., Bi J., Zhang L., Ye B., (2012), "Ultrasound-assisted extraction of three bufadienolides from Chinese medicine ChanSu", Ultrason Sonochem, 19, 1150–1154. [21] Verpoorte R., Svendsen A., Phan Quốc Kinh, (1979), "Chemical constituents of Vietnamese toad venom collected from Bufo melanostictus Schneider: Part I. the sterols", J Ethnopharmacol, 1, 197–202.
[22] Wang Z., Wen J., Zhang J., Ye M., Guo D., (2004), "Simultaneous determination of four bufadienolides in human liver by high-performance liquid chromatography",
Biomed Chromatogr, 18, 318–322.
[23] Xia X., Jin H., Yan S., Zhang W., (2010), "Analysis of the bioactive constituents of ChanSu in rat plasma by high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection", J Pharm Biomed Anal, 53, 646–654.
[24] Xu W., Luo H., Zhang Y., Shan L., Li H., Yang M., (2007), "Simultaneous determination of five main active bufadienolides of Chan Su in rat plasma by liquid chromatography tanhdem mass spectrometry", J Chromatogr B, 859, 157–163.
[25] Yang Z., Luo H., Wang H., Hou H., (2008), "Preparative isolation of bufalin and cinobufagin from Chinese traditional medicine ChanSu", J Chromatogr Sci, 46, 81–85. [26] Ye M., Guo H., Guo H., Han J., Guo D., (2006), "Simultaneous determination of cytotoxic bufadienolides in the Chinese medicine ChanSu by high-performance liquid chromatography coupled with photodiode array and mass spectrometry detections", J Chromatogr B, 838, 86–95.
[27] Zhang Y., Tang X., Liu X., Li F., Lin., (2008), "Simultaneous determination of three bufadienolides in rat plasma after intravenous administration of bufadienolides extract by ultra performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry", Anal Chim Acta, 610, 224–231.
Tiếng Trung Quốc
[28] Zhang Li, He Wen-tong, Chen xiao-yi, Hu Wen-liang, (2004), "The study on acute-toxicity of Bufalin", Acta Academiae Medicinae Cpapf, 13, 10-13.
Tiếng Nhật
[29] Yasuharu Hirai, Shin-ichi Morishita, Chihiro Ito, Matao Sakanashi, (1992), "Effect of bufadienolides and some kinds of cardiotonics on guinea pig hearts", Folia pharmacol, 100, 127-135.
Pha động: acetonitril-acid acetic 0,1%.
Pha động: acetonitril-amoni acetat 0,1%
Gradient 1
Gradient 2
Gradient 3
Tốc độ dòng pha động 0,8 ml/phút
Tốc độ dòng pha động 1ml/phút
Dung môi acetonitril
Dung môi chloroform
Dung môi ethyl acetat
Chiết 1 lần – 5 ml methanol
Cột HLB
methanol
0,1% CH3COOH/MeOH
0,5% CH3COOH/MeOH
Điểm chuẩn 20 ng/ml
Điểm chuẩn 50 ng/ml
Mẫu bột đạm cóc phát hiện có bufalin