Hai quy trình xử lý mẫu dưới đây được đánh giá sơ bộ để lựa chọn: Quy trình 1 [22]:
Cân chính xác khoảng 1g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm, thêm 10 ml methanol lắc votex 1 phút, đồng nhất. Sau đó ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, cô quay ở 400C, hòa cắn bằng 1ml MeOH, pha loãng bằng 10 ml nước, chuyển sang ống ly tâm, ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Lọc qua giấy lọc, rồi cho qua cột HLB. Cột được hoạt hóa bằng 1 ml MeOH, 1ml H2O; mẫu được
nạp sau khi hoạt hóa. Cột được rửa bằng 1ml dung dịch CH3COOH 2% trong MeOH -
H2O (50 : 50) và 1 ml dung dịch NH4OH trong MeOH - H2O (50:50). Rửa giải bufalin bằng 1 ml CH3COOH 0,5% trong MeOH. Lấy dịch rửa giải đem phân tích.
Quy trình 2 [27]:
Cân chính xác khoảng 1g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm, thêm 10 ml MeOH lắc votex 1 phút, đồng nhất, sau đó ly tâm 5 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, cô quay 400C, hòa cắn bằng 1ml MeOH, lọc qua màng 0,22 µm lấy dịch đem phân tích.
Nhằm mục đích tìm ra quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 2 quy trình xử lý mẫu đã nêu ở trên. Cân chính xác khoảng 1g mẫu bột đạm cóc đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml, thêm 100 µl dung dịch chuẩn nồng độ 5 µg/ml vào mỗi ống mẫu như vậy dịch cuối thu được sẽ có nồng độ 500 ng/ml, tiến hành xử lý mẫu theo 2 quy trình trên. Mỗi quy trình tiến hành làm lại 2 lần lấy kết quả trung bình. Kết quả được chỉ ra ở bảng sau:
+1 ml MeOH +1ml H2O
+ 10 ml H2O
Hoạt hóa
Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Kết quả Quy trình 1 Quy trình 2
Clt (ng/ml) 500 500
Ctt (ng/ml) 480 170
R(%) 96 34
Nhận xét: Từ kết quả thu được ta nhận thấy quy trình 1 cho hiệu suất thu hồi tốt nhất. Do đó trong khóa luận này chúng tôi sẽ tập trung khảo sát các điều kiện của quy trình 1 để đưa ra một quy trình xử lý mẫu tối ưu nhất.
Hình 3.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Rửa tạp
+ 10 ml MeOH
Gạn dịch vào bình cô, cô quay ở 400C
Hòa cắn bằng 1ml MeOH
Lọc qua giấy lọc, lấy dịch lọc
Cột HLB đã hoạt hóa
Cột
Rửa giải 1 ml CH3COOH 0,5% trong MeOH
Lắc votex 1 phút; Ly tâm 5 phút, 6000 vòng/phút Cân 1g mẫu/ống ly tâm 50 ml
Chuyển sang ống ly tâm, ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút Vial, LC-MS/MS +1 ml CH3COOH 2% trong MeOH-H2O (50:50,v/v) +1 ml NH4OH 2% trong MeOH-H2O (50:50, v/v)
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết
Dung môi chiết là một yếu tố vô cùng quan trọng quyết định hiệu suất của quá trình xử lý mẫu. Cân chính xác khoảng 1g bột đạm cóc (không chứa bufalin) vào các ống ly tâm 50 ml, thêm chuẩn bufalin nồng độ 250 ng/ml, tiến hành làm theo quy trình 1. Qua tham khảo một số tài liệu [20][25] …, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 5 loại dung môi chiết là methanol, ethanol, ethyl acetate, cloroform, acetonitril. Kết quả thể hiện ở bảng 3.9:
Bảng 3.9: Khảo sát dung môi chiết
Dung môi Methanol Ethanol Ethyl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
acetate Cloroform Acetonitril
Diện tích
pic 45000 40800 33800 214 36300
Nhận xét: Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn methanol làm dung môi chiết.