PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSOR
3.3. SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG:
Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận hơn trong việc ứng như:
Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn. Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễ dàng. Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài.
Sự chuyển khối bị hạn chế. Có thể mất hoạt tính khi cố định. Không có hiệu quả đối với cơ chất rắn. Mất tính thích nghi hình thể.
Nhưng những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới để cố định enzym.
Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều cách. Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các điện cực sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:
Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt biosensor.
Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc và chức năng.
Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài. Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học.
Để cố định các thành phần sinh học trong Biosensor, người ta thường sử dụng các kỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein.
3.3.1. Sự cố định Enzym:
a. Sự cố định bằng hấp thụ vật lý:
Điện cực Enzym đầu tiên được chế tạo bởi Updike và Hicks bằng cách cố định Enzym Glucose oxidase trong một lớp gel polyacrylamide, sau đó Enzym này được gắn lên màng Plastic của điện cực oxy. Hoặc có thể cố định một enzym lên một thành phần nhạy cảm của một điện cực bằng màng thẩm thấu ngăn cản sự khuếch tán protein. Guibault và Shu đã chế tạo một điện cực enzym nhạy cảm với ure bằng cách trải một dung dịch huyền phù của enzym urease lên bề mặt của điện cực có màng nilon và bao bọc khít hoàn toàn bằng màng thẩm thấu, sau đó điện cực enzym này được rửa sạch với nước và sẵn sàng để sử dụng.
Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:
Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Valderwaalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang.
Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ).
Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion:
agarose, chitin.
Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide của kim loại.
Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose.
Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl.
Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang.
Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định: Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận
với nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định.
pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ở protein enzym. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. Đồng thời sự thay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym.
Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định.
Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym.
Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao. Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn.
Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài. Do đó sự cố định hóa học, sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài.
b. Sự cố định bằng liên kết ngang (cross – linking immobilization):
Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan.
protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang.
Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng. Tác nhân có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:
Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang.
Có 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang: Phương pháp ngâm (Immersion method)
Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hóa trị I.
Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8. Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyết thanh bò 17.5%, sau đó thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồng độ cuối cùng 0.8%. Khuấy dung dịch trong 2 phút.
Chuẩn bị bề mặt hoạt động: Đầu tiên điện cực cation được rửa bằng nước cất, sau đó lau khô bằng giấy lọc. Nhúng ngập bầu điện cực trong dung dịch cố định trên, xoay điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dung dịch cố định đồng nhất. Một vòng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym này bám chặt lên bầu điện cực. Sau đó rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, và cuối cùng bằng nước cất để tách rửa hay trung hòa tác nhân tạo liên kết ngang.
Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các Enzym lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ.
Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method):
Nguyên tắc: Nhỏ 10 ml dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sau đó nhỏ 10ml dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde.
Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điện cực cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene.
Hình 3.3: Phương pháp kết hợp trực tiếp
Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịch enzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym. Điện cực này sau đó được sấy khô ở 4oC và xoay. Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từ một khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt. Sau khi tạo liên kết ngang, điện cực enzym được rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng.
Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2mm) và các biosensor tạo ra có thời gian đáp ứng cực ngắn (5-10s).
Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang.
Hình 3.4: Phương pháp sử dụng bình phun
Sử dụng màng membrane:
Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym được cố định lên một diện tích rộng của màng nylon bằng những dĩa nhỏ chứa membrane enzym có cùng mẻ và sự cố định giống nhau. Sau đó các màng này được kẹp vào trong bộ biến năng. Màng membran tăng cường-gia cố này có phần sợi do đó cải thiện tính chất cơ học của màng enzym.
Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng các màng membrane xốp sẵn có trên thị trường. Những màng này có các nhóm chức liên kết có khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym. Các màng này sau đó đem ngâm trong dung dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất cơ học hữu dụng.
3.1.3. Sự cố định cofactor:
Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháp hấp thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang.
Vi sinh vật có kích thước lớn hơn enzym do đó dễ dàng cố định bằng phương pháp vật lý. Chúng có thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩm thấu và màng lọc membrane như millipore 0.22 mm – chế tạo từ ester cellulosic. Toàn bộ tế bào vi sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởi glutaraldehyde. Màng collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý.
Màng kỵ nước và vi sinh vật có thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếch tán khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vật được nhốt trong các lỗ màng lọc cellulose acetate, sau đó rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặt màng vi sinh vật trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịch đệm để loại bỏ các thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo. Các điện cực vi sinh vật được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong dung dịch đệm phosphate.
Hình 3.5: Điện cực vi khuẩn đo dòng điện
Cũng có thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biến năng. Vi sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị để tránh sự nhả protein.
Vi khuẩn acetic thuộc loài Acetobacter xylinum có khả năng tạo ra màng mỏng trong môi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và có những tính chất cơ học nhất định thì có thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩm thấu. 3.3.2. Cố định các tác nhân miễn dịch:
Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên các bộ biến năng khác nhau.
trúc là protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự như phương pháp cố định enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane.
Cố định trực tiếp lên bộ biến năng:
Các kháng thể có thể được gắn lên một điện cực carbon bằng liên kết cộng hóa trị. Các nhóm COOH được tạo ra trên điện cực carbon bằng phản ứng điện hóa trong môi trường acid nitric HNO3 và kali bicromat K2Cr2O7 và gắn với kháng thể bằng một tác nhân tạo liên kết ngang như carbodiimide.
Hoặc có thể cố định bằng phương pháp hấp phụ kháng thể lên các lớp kim loại vàng hay bạc lắng trên thủy tinh. Sau đó dùng phương pháp dò cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt.
Sự cố định bằng màng membrane:
Các kháng thể cũng có thể được cố định lên các màng membrane theo trình tự như sau: đầu tiên màng bromo-acetylcellulose được ngâm trong dung dịch chứa hexamethylene diamine, sau đó ngâm trong dung dịch diepoxy butadiene, dung dịch này tạo ra các nhóm sẽ phản ứng với kháng thể, cuối cùng màng này với kháng thể đã đuợc cố định được rửa với dung dịch ethanolamine để loại bỏ những nhóm epoxy không phản ứng.
Kháng thể cũng có thể được cố định trong các mạng nylon hoặc hấp thụ vật lý bằng các màng collagen và polyvinylbutyral, sau đó được lắp vào điện cực ISFET. Màng này được hoạt hóa với glutaraldehyde trước khi kết hợp với kháng thể. Các kháng thể cũng có thể được cố định lên sợi quang học.
b) Sự cố định kháng nguyên:
Kháng nguyên là các hợp chất bao gồm protein, hydratcarbon,…chúng được cố định bằng những cách khác nhau, không như kháng thể và enzym. Yếu tố quyết định tính kháng nguyên dinitrophenol (DNP) có thể được kết hợp với một chất mang ion dibenzo- 18-crown-6 (DB18C6) và sau đó được cố định trong màng polymer. Đầu tiên, ether này được chuyển thành dẫn xuất dạng trans-dinitro và sau đó thành dẫn xuất arylaminey thích hợp cho việc kết hợp với fluorodinitrobenzene. Phức hợp này được hòa tan trong tetrahydrosulfan và thêm dibutylsebacate, sau đó kết hợp phức hợp này trong màng polyvinylchloride (PVC). Cuối cùng màng kháng nguyên được chia thành những đĩa nhỏ được gắn lên trên đỉnh của điện cực. Các biosensor tạo ra nhạy cảm trực tiếp với các kháng thể. Tuy nhiên, điện cực tạo ra bằng cách này vẫn có nhược điểm đó là DNP có một ái lực đối với ion K+ của dung dịch chất điện phân bên trong điện cực, do đó cho kết quả không chính xác. Để hạn chế điều này, một điện cực rắn với nhựa epoxy nhồi đá granite được chế tạo. Đầu tiên, người ta đổ nay nhựa thông vào bên trong ống PVC chứa
DNP-kháng nguyên và 15% triocyl acetate vào trong lỗ khoan của nhựa thông.
Hình 3.6: Sự cố định kháng thể lên màng membrane bromo-acetylcellulose
Hình 3.7: Điện cực kháng nguyên dùng PVC rắn với DNP
membrane thì sự kết hợp miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhưng khó được phát hiện bởi bộ biến năng, thông thường phản ứng miễn dịch có thể được dò khi bổ sung vào enzym để xúc tác quá trình phản ứng. Kháng nguyên hay kháng thể được gắn với một enzym sử dụng kỹ thuật EIA (miễn dịch enzym) hay ELISA. Enzym được gắn với tác nhân miễn dịch bằng tác nhân tạo liên kết ngang hai chức glutaraldehyde.
Tuỳ thuộc vào từng loại bộ biến năng mà gắn kháng nguyên hay kháng thể với enzym cho phù hợp: Nếu sử dụng bộ biến năng là điện cực pO2 thì kháng nguyên được gắn với enzym glucose oxidase hoặc catalase. Khi bộ biến năng là điện cực pNH3kháng nguyên được gắn với enzym urease.
3.3.3.Cố định mô, cơ quan và chemoreceptor:
a) Cơ quan và mô thực vật – động vật:
Đầu tiên, một lát mô thực vật hay động vật được cắt ra, và chèn vào giữa hai màng bán thấm rồi gắn chúng lên bộ biến năng. Thường dùng điện cực pO2, pCO2, hay pNH3. Mô động vật có thể là gan bò, gan thỏ, bắp thịt thỏ hay cơ ruột, hay thành phần tế bào. Các cơ quan này được gắn vào bộ biến năng sẽ làm cho Biosensor chọn lọc hơn bởi vì chúng chứa những enzym đặc biệt.
Biosensor gắn mô thực vật – động vật nhìn chung có thời gian đáp ứng dài hơn Biosensor gắn enzym. Thời gian đáp ứng nhanh của Biosensor này có thể đạt được nếu như gắn các mô này trong bột than dạng paste nhằm tạo ra sự tiếp xúc lớn hơn giữa chất xúc tác sinh học và thành phần cảm ứng: Cắt những lát mô và nhồi vào trong hồ vữa, sau đó trộn với dầu khoáng và bột than chì để tạo hỗn hợp nhão và cuối cùng trải đều lên đầu điện cực.
b) Chemoreceptor:
Receptor là râu nhỏ của loài cua xanh Callinectes sapidus có sợi thần kinh được sử dụng như bộ biến năng để truyền dẫn xung động thần kinh gây ra bởi khứu giác hay vị giác, chúng được cố định trực tiếp vào điện cực dò Pt của điện cực đo điện thế. Điện cực so sánh Ag/AgCl được nhúng vào dung dịch muối, và sẽ tạo ra sự chênh lệch điện thế so với điện cực dò. Bằng việc dùng các liều tác nhân kích thích khác nhau vào trong dòng chất mang sẽ gây ra những thay đổi về cấu tạo của receptor và kết quả tạo ra một sự thay