ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR
5.2. ỨNG DỤNG TRONG MÔI TRƯỜNG
Các điện cực enzym sử dụng trong phân tích môi trường có thể chia thành ba nhóm dựa vào đặc điểm của một phản ứng enzym:
Nhóm thứ nhất : các chất được định lượng là cơ chất của phản ứng enzym. Nhóm thứ hai: các chất được định lượng là các chất kìm hãm hoạt tính xúc tác của enzym. Ví dụ, các hợp chất cơ phospho và cacbonat.
Nhóm thứ ba: nồng độ các ion kim loại dược phát hiện nhờ vào việc chúng liên kết với phần “apoenzym” do đó phục hồi hoạt tính của enzym.
a) Định lượng ion kim loại nặng
Các enzym thuộc nhóm metalloenzym cần có các ion kim loại tham gia vào trung tâm hoạt động để duy trì được hoạt tính xúc tác của enzym, do đ1o khi các ion kim loại này bị tách ra khỏi enzym ( ví dụ, do tác dụng của tác nhân tạo phức) thì sẽ làm mất hoạt tính xúc tác của enzym.hoạt tính xúc tác của enzymcó thể phục hồi khi cho enzym tiếp xúc với môi trường chứa ion kim loại thì ion kim loại sẽ thu hút lại vào trung tâm hoạt động của enzym. Do đó có thể định lượng được nồng độ kim loại nặng trong mẫu thông qua việc xác định hoạt động xúc tác của enzym tạo thành sau khi cho phần “apoenzym” đã được cố định tiếp xúc vơi mẫu.
mol) và có thể ph1t hiện được bất kỳ một kim loại nào có mặt trong nhóm metalloenzym.
Bảng 5.3: giới thiệu một số điện cực xác định ion kim loại
Kim loại Enzym Điện cực Nồng độ (mmol/l)
Hg (II) Urease Điện cực NH4+ 0 – 150 nm/l
Zn (II) apoenzym: phosphatasephosphatase kiềm Điện cực nhiệt điện trởPH – ISFET 1.1 – 1 (sai số 2.3%) 0.01 – 1
Cu (II) galactooxydaseApoenzym: Điện cực Pt/Ag/AgCl 0.1 – 1 (sai số 7%) Cu (II) Apoenzym: tyrosinase Điện cực O2 < 0.5
b) Định lượng phenol:
Việc phân tích nồng độ các hợp chất phenol dựa trên phản ứng:
Bảng 5.4: Điện cực dùng tyrosinase:
Điện cực Nồng độ phát hiện Sai số Thời gian
Điện cực graphit với TCNQ 0.23 – 0.65 12 – 35 s Điện cực O2 (Clark) 1 – 46 (trong hexan) 5 – 190 (trong dung dịch đệm) 4.4% (trong hexan) 7.2% (trong dung dịch đệm) < 2 phút Điện cực O2
(Clark) 0.1 – 5 (trong dung dịch đệm và cloroform 3 phút
c) Định lượng phosphat, nitrit, nitrat, sulfat
Các hợp chất này ngày càng có mặt nhiều trong môi trường, đặc biệt là trong nước uống. Sự gia tăng nguồn nitơ, phospho trong nước có thể gây ra hiện tượng phì dưỡng, gây mất cân bằng sinh thái (theo tiêu chuẩn EC, nồng độ cho phép của phospho là: 5mg/l
Tuy nhiên, nồng độ của phospho trong nước có thể được định lượng bằng các điện cực enzym.
Theo Kubo(1991), nồng độ phosphat có thể xác định bằng cách sử dụng điện cực pyruvatoxydase từ pediococcus xúc tác với oxy hoá pyruvat trong điều kiện có mặt phosphat và O2 để tạo thành acetylphosphat, hydro peroxyt và CO2. Lượng O2 tiêu thụ được dùng để dịnh lượng phosphat:
Các hợp chất chứa nitrat, nitrit có thể định lượng theo phản ứng oxy hóa khử xúc tác bởi nitratreductase và nitritreductase:
Bảng 5.5: Định lượng nitrit, nitrat, sulfat
Chất Enzym Điện cực chỉ thị Giới hạn phát hiện(mmol/l)
Nitrit Nitrit reductase Điện cực NH3 50
Nitrate Nitrat reductase vànitrit reductase Điện cực NH4+ 50
Sufate Arylsulfatase Điện cực Pt 100
Bảng 5.6: Điện cực enzym định lượng phosphate:
Enzym (mmol/l)Nồng độ Sai số(%) Điện cựcchỉ thị Thời gian đápứng (phút) Tính ổn định
Phosphatase và glucooxydase ≥ 0.01 5.9 H2O2 5 – 10 nghiệm (TN)/> 100 thí 3 tháng Nucleosiphosphorilase và xanthinoxydase 0.3 – 1 mM 10 O2 3 > 70 TN/ 1tháng Nucleosiphosphorilase 10 – 250 5.9 H2O2 2 30 TN
Pyruvat oxydase 12 – 80 5.9 O2 7 7 ngày (khả năng đáp ứng giảm 50%) Nucleosiphosphorilase và xanthinoxydase 0.5 – 100 5 O2 1.5 > 8 ngày/ 300 ngày d) Định lượng các chất độc
Các loại thuốc trừ sâu phospho có độc tính rất cao, ngoài tác dụng độc sơ cấp, chúng còn làm biến đổi các quá trình trao đổi chất của tế bào bằng cách tác dụng lên các enzym thiết yếu của tế bào như esterase, oxydase, phosphorylase, dehydrogenase. Theo tiêu chuẩn EC, nồng độ tối đa cho phép của dư lượng các chất này trong nước uống là 0.1 mg/l đối với mỗi loại riêng biệt và 0.5 mg/l đối với hỗn hợp. Việc xác định các chất độc này được thực hiện bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) hoặc sắc ký khối phổ (GC/MS) nhưng thiết bị đắt tiền, phương pháp phức tạp và trình độ kỹ thuật cao.
Sử dụng điện cực có gắn enzym cholinesterase dựa vào đặc điểm các chất độc này sẽ kìm hãm enzym này đem lại nhiều thuận lợi trong phân tích.
Quá trình phản ứng thủy phân cholin nhờ cholinesterase như sau:
Phản ứng oxy hóa tạo thành H+, trên cơ sở đó có thể dùng điện cực pH hay dùng phản ứng oxy hóa tiocholin tại điện cực Pt để xác định hoạt độ enzym.
e) Kỹ thuật ELISA trong xác định dư lượng thuốc trừ sâu
Kỹ thuật ELISA để xác định dư lượng trừ sâu gồm hai phương pháp cd – ELISA (competitive direct ELISA – ELISA cạnh tranh trực tiếp) và phương pháp ci – ELISA (competive indirect ELISA – ELISA cạnh tranh gián tiếp).
Trong cd – ELISA, kháng thể được cố định trên bề mặt các giếng giá thể rắn, cho mẫu thuốc trừ sâu có hàm lượng nhất định đã được gắn enzym và thuốc trừ sâu cần phân tích vào các giếng này, chúng sẽ cạnh tranh để bám vào kháng thể. Sau một thời gian phản ứng các chất còn dư sẽ bị rửa trôi. Cuối cùng, cơ chất này sẽ bị enzym xúc tác và tạo ra các sản phẩm có màu sắc. Cường độ màu tỷ lệ nghịch với lượng thuốc
do tính cạnh tranh kém hơn sẽ bị giữ lại ít, màu yếu và ngược lại.
Trong kỹ thuật ci – ELISA, các giếng được phủ một lớp thuốc trừ sâu liên kết với protein, còn thuốc trừ sâu cần xác định được thêm vào với một lượng kháng thể cố định. Để một thời gian, thuốc trừ sâu cần phân tích (kháng nguyên) và thuốc trừ sâu liên kết sẽ cạnh tranh bám vào các kháng thể, lượng thuốc trừ sâu càng nhiều thì lượng kháng thể ban đầu bị giữ lại bằng cách cho cơ chất vào, chuyển hóa tạo ra các sản phẩm có màu. Cường độ màu tỷ lệ nghịch với lượng chất cần xác định trong mẫu ban đầu.
Phương pháp này có ưu điểm là giá thành rẻ, dễ tự động hóa, nhưng nhược điểm là trong một thời gian chỉ phát hiện được một loại thuốc trừ sâu.
f) Điện cực đếm vi sinh vật:
Vi sinh vật được đếm bằng thí nghiệm vi sinh vật, nhưng thường tốn nhiều thời gian, đặc biệt khi xác định vi sinh vật gây bệnh như Samonella và Listeria sp. Khi xác định
Samonella, trước tiên cần 24 giờ để làm môi trường, làm cho vi sinh vật cần xác định từ trạng thái tĩnh trong thực phẩm sang trạng thái hoạt động. Sau đó canh trường được ủ để
Samonella phát triển. Sau 24 giờ phát triển, cấy môi trường có chứa vi sinh vật sang đĩa thạch, một hoặc hai ngày sau xác định lượng Samonella. Kết quả tìm được các loại kháng thể như somatic (O) hay flagella (H). Phương pháp này chính xác nhưng thời gian lâu gần 5 ngày, kết quả đưa ra chỉ mang tính định tính.
Các dụng cụ phân tích nhanh hơn thuộc kỹ thuật ELISA đã được sử dụng để xác định
Samonella, Staphylococcus và các nội độc tố: mẫu thực phẩm được xử lý bằng enzym để đạt tới một kích thước nhất định, sau đó được lọc trên màng lọc kẻ ô kỵ nước HGMF (hydrophobic grid membrane filter) để chuẩn bị cho bước xác định tiếp theo.
Hình 7.2: Biosensor phát hiện E.coli