ĐIỆN CỰC ENZYM
4.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT:
thời giữa enzym và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo ra chỉ một sản phẩm:
Tốc độ phản ứng: (2)
Với Km là hằng số Michaelis, ,
Vm là tốc độ phản ứng cực đại khi [S] >> Km, Vm = k+2 [E0] – [E0]: nồng độ enzym ban đầu.
[S]: nồng độ cơ chất [P]: nồng độ sản phẩm.
Đối với enzym đã biết, tốc độ phản ứng V là hàm của tỷ số [S]/Km. Khi , thì
. Khi thì .
Bên trong lớp màng enzym, tốc độ phản ứng bao gồm cả tốc độ khuếch tán nhiều cơ chất trong dung dịch:
(3)
DS,DP là hệ số khuếch tán của cơ và sản phẩm ở bên trong lớp màng enzym
x: khoảng cách giữa một điểm cho trước trong màng enzym và bề mặt ngoài của điện cực.
4.2.1. Sự trả lời tín hiệu ở trạng thái nhanh:
Phương trình (3) và (4) cho biết nồng độ của cơ chất và sản phẩm ở bề mặt bộ biến năng phụ thuộc vào hằng số Michaelis Km, vận tốc phản ứng cực đại Vm của lớp màng enzym, bề dày của lớp màng và hệ số khuếch tán DS, DP. Giả thiết rằng nồng độ của sản phẩm ở bề mặt ngoài của điện cực bằng không (do sự khuếch tán chỉ xảy ra ở trong lớp màng enzym. Nhiệt độ, Vm, Km, DS, DP xem như không đổi trong suốt toàn bộ lớp màng. Đồng thời giả định rằng bộ biến năng không làm thất thoát sản phẩm hay cơ chất.
Ta có:
Với e: bề dày của lớp màng enzym. Khi đó phương trình (3) và (4) trở thành:
(3’)
(4’)
Ở giai đoạn này, phản ứng xảy ra nhanh chóng, có sự kết hợp giữa cơ chất và enzym để tạo ra phức hợp enzym - cơ chất.
Nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm trong một đơn vị thể tích dung dịch là Km, thời gian khuếch tán của cơ chất qua bề dày của lớp màng là e2/DS. Ở thời gian t = 0, nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm trong màng bằng 0. Nồng độ cơ chất trong dung dịch luôn luôn giữ không đổi và bằng Km.
Km = 2,1.10-5 mol.cm-3 e = 2,5.10-3 cm
DS = DP = 1,2.10-5 cm2.s-1.
Thời gian để đạt tới trạng thái ổn định: t = 0.7. e2/DS = 36 giây.
Tỷ số e2/DS xác định thời gian đáp ứng của Biosensor bởi vì nó biểu diễn thời gian mà lớp màng enzym đạt đến trạng thái ổn định. Có thể giảm thời gian này bằng cách tăng tính thấm của màng đối với cơ chất (tăng DS) hay giảm bề dày của lớp màng (giảm e), trong đó giảm e là phương pháp hiệu quả nhất. Nhưng giảm e sẽ ảnh hưởng đến tính chất vật lý của màng enzym. Ngoài ra thời gian đáp ứng của Biosensor luôn lớn hơn thời gian đáp ứng của bộ biến năng.
4.2.2. Sự trả lời tín hiệu ở trạng thái ổn định:
Trong giai đoạn ổn định, thời gian đáp ứng của Biosensor phụ thuộc rất nhiều vào tỷ số [S]/Km. Khi [S]/Km lớn, tốc độ phản ứng tiến tới giá trị cực đại Vm, tỷ lệ thuận với nồng độ enzym cố định. Sau đó tốc độ phản ứng độc lập với nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm ở bề mặt tiếp xúc với bộ biến năng không đổi khi nồng độ cơ chất lớn.
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn nồng độ sản phẩm theo nồng độ cơ chất ứng với các giá trị s khác nhau.
Đường cong biểu diễn mối quan hệ phụ thuộc giữa nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm có đặc điểm:
tăng theo
Độ dốc của đường tuyến tính không phụ thuộc vào giá trị s.
Khi s đủ lớn, đường tuyến tính này dần đạt đến đường thẳng tại điểm có nồng độ [P]e = [S]o.
Vùng tuyến tính này phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của enzym sử dụng. Vùng tuyến tính này tương đương với động học enzym bậc một theo nồng độ cơ
chất, ngược lại vùng có nồng độ cao hơn thì tương đương với động học bậc không. a) Động học phản ứng enzym bậc I:
Động học enzym xảy ra khi [S] << Km, khi đó, phương trình (3) và (4) đạt đến trạng thái
ổn định: :
(6)
(7)
Nồng độ sản phẩm ở bộ biến năng được tính theo công thức:
(8), trong đó l2 = Vm/(DSKm) và cosh(le) là hàm cos hyperbolic của (le).
Nồng độ sản phẩm [P]e tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất [S]o b) Động học bậc 0:
Động học bậc 0 xảy ra khi [S] >>Km ở trạng thái ổn định và phương trình (3) và (4) trở thành:
(11)
khi đó [P]e = Vme2/2DP, nồng độ cơ chất được dò bởi bộ biến năng thì độc lập với cả nồng độ cơ chất và Km, khi nồng độ cơ chất [S]>>Km thì biosensor không còn khả năng xác định cơ chất nhưng có thể xác định chất ức chế, chất này ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng cực đại Vm.
4.2.3. Chất ức chế enzym:
Chất ức chế (chất kìm hãm) enzym là những hợp chất hóa học có hình dạng và cấu trúc tương tự như cơ chất, sẽ làm chậm quá trình phản ứng enzym.
Chất ức chế được chia làm ba loại:
Chất kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibitors)
Chất kìm hãm không cạnh tranh (Non – competitive inhibitors) Chất kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibitors)
Trong đó KI là hằng số phân ly của phức hợp EI. Tốc độ phản ứng k hi có mặt chất ức chế, VI được xác định:
Đặt i = [I]/KI và s = [S]/Km thì khi đó .
Mức độ kìm hãm của phản ứng được đặc trưng bởi đại lượng r, (0 < r < 1)
Mà V = Vm [s / (1+s)] nên . Do đó có thể giảm độ kìm hãm nếu nồng độ cơ chất tăng. Sự kìm hãm cạnh tranh có thể bị loại bỏ nếu như dư nồng độ cơ chất.
b) Chất kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibitors)
Do đó độ kìm hãm được tính theo công thức: , gia tăng theo nồng độ cơ chất [S] khi cùng nồng độ chất kìm hãm [I].
c) Chất kìm hãm không cạnh tranh (non – competitive inhibitors)
Chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với cả enzym và phức hợp ES tại một vị trí khác với tâm hoạt động của enzym.
Kết quả tạo ra 3 phức hợp ES, EI, ESI mà chỉ có ES tạo ra sản phẩm của phản ứng. Chấp nhận rằng tương tác qua lại giữa enzym và chất cạnh tranh không bị ảnh hưởng bởi cơ chất, do đó KI ~K’I, khi đó tốc độ phản ứng kìm hãm enzym là:
Khi đó , độc lập với nồng độ cơ chất. Do đó loại chất kìm hãm này không được loại bỏ bởi sự dư thừa cơ chất.
đại.
KP = r.Km và VP = Vm (phản ứng kìm hãm cạnh tranh) KP = Km / r và VP = Vm /r (phản ứng kìm hãm phi cạnh tranh) KP = Km và VP = r.Vm (phản ứng kìm hãm không cạnh tranh).
d) Điều khiển phản ứng kìm hãm:
Khi enzym được cố định lên chất mang rắn, phản ứng xảy ra trong pha dị thể do tâm hoạt động của enzym nằm trong pha rắn của chất mang và cơ chất nằm trong pha lỏng của dung dịch. Nồng độ cơ chất khác nhau tại mọi điểm trong chất mang, do đó tốc độ phản ứng enzym không giống nhau. Nồng độ cơ chất trong lớp màng enzym luôn thấp hơn so với trong dung dịch.
Như vậy để loại bỏ ảnh hưởng của chất kìm hãm đến phản ứng enzym, cần có sự dư thừa nồng độ cơ chất, nồng độ enzym cao và độ tinh sạch cũng như tính đặc hiệu của enzym.
e) Sự đáp ứng tính hiệu của điện cực enzym khi có mặt các chất kìm hãm:
Đồ thị log – log mô tả mối quan hệ giữa nồng độ sản phẩm theo nồng độ cơ chất theo các kiểu kiềm hãm khác nhau:
Đồ thị a) : Kìm hãm cạnh tranh.
Tốc độ phản ứng khi có mặt chất kìm hãm cạnh tranh độc lập với nồng độ chất kìm hãm thuộc vùng có động học bậc 0 và được mô tả theo phương trình:
Chất kìm hãm cạnh tranh chỉ phụ thuộc vào giá trị Km mà không ảnh hưởng giá trị cực đại [P]e. Ngược lại, vùng tuyến tính có động học bậc I, theo phương trình:
với (le)2 = s = Vm.e2/ KmD.
Các chất kìm hãm cạnh tranh làm tăng giá trị Km, giảm s và do đó làm giảm log[P]e.
tuyến tính có đường cong đáp ứng là như nhau đối với mọi giá trị r. Ngược lại, những chất này làm giảm vùng động học bậc 0 qua việc giảm giá trị Vm xuống Vm/r.
Hình 4.4: Sự trả lời tín hiệu của điện cực enzym theo các kiểu kìm hãm khác nhau
Đồ thị c): kìm hãm không cạnh tranh:
Chất kìm hãm này chỉ ảnh hưởng đến giá trị s (giảm) thông qua Vm, do đó vùng tuyến tính và vùng động học bậc 0 ở mỗi giá trị r là khác nhau.
Như vậy qua việc quan sát đường cong trả lời của điện cực đo điện thế sẽ xác định được kiểu kìm hãm phản ứng enzym
4.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TRẢ LỜI CỦA ĐIỆN CỰC
ENZYM
thời gian đạt được trạng thái mà tại đó nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm là hằng số.
Hình 4.5: Sự trả lời tín hiệu của điện cực acetylcholinesterase ở các nồng độ cơ chất khác nhau
Giá trị này rất khó đánh giá chính xác do phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bộ biến năng, sự đảo trộn, phương pháp cố định enzym. Nếu sử dụng màng enzym urease cố định lên điện cực cation hóa trị I thì cho thời gian trả lời dưới 1 phút. Nhưng nếu cố định nó lên điện cực pCO2 cho thời gian dài hơn 2-3 phút. Đó là do khi dùng điện cực pCO2 thì xảy ra sự khuếch tán CO2 qua màng thấm khí. Sử dụng phương pháp cố định bằng liên kết ngang sẽ tạo ra màng enzym cực mỏng 1 – 2mm cho thời gian trả lời chỉ trong vài giây đến vài phút. Khuấy đảo mẫu để tăng khả năng khuếch tán khí cũng giảm được thời gian đáp ứng.
4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng tín hiệu của biosensor:
Độ bền của điện cực enzym phụ thuộc rất nhiều vào các thông số vật lý và hóa học. Vật lý: Độ dày của màng enzym: màng càng mỏng thì độ bền càng tăng
Nồng độ enzym càng lớn thì thời gian trả lời càng tối ưu Bề mặt bộ biến năng
Hóa học: phương pháp cố định enzym: enzym cố định lên màng thẩm thấu ít bền hơn enzym cố định trong màng gel. Enzym cố định bằng liên kết ngang cho điện cực enzym có độ bền nhất
Vì pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym và pH ảnh hưởng đến sự phân ly sản phẩm của phản ứng enzym được phát hiện hiện bởi bộ biến năng nên pH cũng ảnh hưởng đến sự trả lời tín hiệu của điện cực enzym.
Hoạt tính enzym giảm có thể điều chỉnh bằng cách tăng nồng độ enzym trong lớp màng, khi đó cơ chất bị biến đổi ở mức độ lớn nhất nên điện cực enzym ít phụ thuộc vào pH.
Hình 4.6: Sự phụ thuộc của tín hiệu trả lời vào pH của điện cực AchE ở 25oC
b) Anh hưởng của nhiệt độ:
Khi nhiệt độ tăng sẽ làm cho hoạt lực xúc tác của enzym e tăng do đó tốc độ phản ứng cũng tăng, nhưng nhiệt độ cao làm biến tính enzym.
Tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ khuếch tán của các chất hóa học khác nhau trong màng enzym do đó làm giảm thời gian trả lời tín hiệu.
Trong vùng nhiệt độ từ 10 – 40oC: tín hiệu trả lời tương đối ổn định, trên 40oC, hoạt tính enzym bị biến tính do đó tín hiệu trả lời sẽ giảm nhanh chóng, nhiệt độ dưới 10oC hoạt tính enzym bị yếu nên tín hiệu trả lời thấp.
Acetylcholin 10 M
c) Anh hưởng của các hợp chất khác:
Ảnh hưởng tới bộ biến năng:
Một bộ biến năng có thể được dùng để xác định nhiều chất khác nhau như có thể dùng điện cực pNH4 trong đo nồng độ ure, nhưng nó sẽ phát hiện các ion NH4+, Li+, Na+, K+. Do đó làm ảnh hưởng đến tính chính xác của phép đo.
Vì vậy, tùy sản phẩm tạo thành mà dùng bộ biến năng nhạy cảm đặc biệt với sản phẩm cho phù hợp. Trong trường hợp trên nên dùng điện cực pCO2 để loại bỏ bớt ảnh hưởng của các hợp chất ion.
Anh hưởng đến hoạt tính enzym:
Trong mẫu thường có chất ức chế cũng như chất kích thích phản ứng enzym, khi đó chúng sẽ kìm hãm hay gia tăng tốc độ phản ứng, do đó ảnh hưởng đến tín hiệu trả lời của điện cực enzym. Nếu trong mẫu có mặt chất ức chế thì có thể loại bỏ chúng bằng cách tăng nồng độ enzym trong màng enzym.
Khi xác định nồng độ ure trong máu có mặt chất ức chế NaF, nếu điện cực dùng 5 đơn vị hoạt độ urease trong 1 mm3 thì sẽ không bị ảnh hưởng đến sự trả lời tín hiệu của điện cực bởi nồng độ NaF tới 5.10-2M, còn nếu dùng 0.5 đơn vị hoạt độ trên 1 mm3 thì tín hiệu trả lời bị ảnh hưởng ở {NaF] = 3.10-3M.
Đồ thị a): Lớp enzym cố định có nồng độ thấp:
Nồng độ cơ chất giảm khi khuếch tán vào trong bộ biến năng, nồng độ này có giá trị [S]e ở bề mặt bộ biến năng, sản phẩm khuếch tán từ lớp màng enzym vào bề mặt bộ biến năng [P]e luôn nhỏ hơn nồng độ cơ chất ban đầu [S]o. Ở trạng thái ổn định, tại mọi điểm trong màng enzym ta luôn có [S] + [P] = [S]0.
Đồ thị b): Lớp màng enzym có nồng độ cao:
Khi nồng độ cơ chất cao, tốc độ biến đổi cơ chất nhanh, do đó phản ứng chỉ xảy ra ở một phần của màng enzym. Cuối màng, nồng độ cơ chất [S]e = 0, vùng này gọi là “deadcore”. Xung quanh vùng này, enzym có hoạt tính khác so với hoạt tính enzym cố định, nồng độ sản phẩm tiến tới giá trị [P]e và giá trị này bằng với [S]0 trong mẫu . Do đó không có sự ảnh hưởng của chất ức chế trong vùng này nên có thể loại bỏ ảnh hưởng của chất kìm hãm bằng việc dùng nồng độ enzym cao trong màng.
Hoạt tính của enzym cũng bị ảnh hưởng nếu dùng enzym không đặc hiệu. Cho nên cần sử dụng các enzym có tính đặc hiệu cao với cơ chất cũng như tinh khiết khi cố định lên màng enzym.
Anh hưởng đến cơ chất:
Khi có mặt các chất khác, nó sẽ làm giảm khả năng khuếch tán của cơ chất vào trong màng enzym, cũng như kìm hãm quá trình phản ứng enzym, do đó cần loại bỏ các chất
Chất phân
tích Enzym (E) Kỹ thuật cố định Bộ biến năng Thời gianđáp ứng Vùng tuyến tính(M)
Ure Urease E + polyacrylamide pNH4 25 – 60 giây 5.10-5 – 10-2 E + BSA + GA pNH4 30 giây –1 phút 10-4 – 10-2 E + polyacrylamide pNH4 (nonactine) 30 – 40 giây 10-5 – 2.10-2 E + đồng polymer methacrylamide – acrylamide pH
(thủy tinh) 5 – 10 giây 5.10-5 – 5.10-4 E + BSA + GA PH ( 1 – 1.5 phút 2.10-4 – 2.10-3 (E) hòa tan/màng thẩm thấu pCO2 1 – 5 phút 10-4 – 10-1
E + BSA + GA pCO2 2 – 3 phút 3.10-4 – 10-2 E + BSA + GA pCO2 1 – 2 phút 3.10-4 – 10-2
E + GA pNH3 1.5 – 2 phút 10-4 – 10-2
(E) hòa tan/ màng cellophane pNH3 5 – 8 phút 5.10-4 – 7.10-2 E + BSA + GA pNH3 2 – 3 phút 3.10-4 – 10-2
E / nylon pNH3 26 – 38 giây 0.2 – 10 mg/dl
Glucose Glucose oxidase E + BSA + GA Pt – Ir - 1 – 150 mg/dl
Acid amin L – amino acid oxidase E + polyacrylamide pNH4 3 – 5 phút 2.10-4 – 2.10-3 D – amino acid oxidase E + polyacrylamide pNH4 1 – 2 phút 10-4 - 5.10-3 L – amino acid
oxidase E + BSA + GA pNH4 30 giây-1 phút 10-4 – 10-2
Glutamin Glutaminase E / nylon / cellophan pNH4 1 – 2 phút 10-4 – 10-1 E / màng thẩm thấu pNH3 4 – 5 phút 10-4–2.10-3 Tyrosin decarboxylaseTyrosine E / giấy thẩm thấu pCO2 1 – 5 phút 3.10-4–5.10-3
decarboxylase Phenyl
alanin ammonia lyasePhenylalanin E / vi lỗ pNH3 12 phút 10-4–6.10-4
Methionin Methionin lyase E + BSA + GA pNH3 3 phút 10-5 – 10-2
Histidin Histidin ammonialyase E + BSA + GA pNH3 3 – 8 phút 10-5 – 10-2 Aspartam Carboxypeptidase
A, L-aspartase E + BSA + GA pNH3 4 – 8 phút 4,25.10-4– 8,1.10-3 Amygladin b - glucosidase E + polyacrylamide pCN 10 – 30 phút 4.10-5–10-3
Penicillin Penicillinase E + polyacrylamide pH 2 – 3 phút 4.10-5–10-3