2.2.1.1 Hoạt hoỏ cỏc vi sinh vật [15]
- Đối với vi khuẩn: Các vi khuẩn bảo quản trong môi trường thạch nghiêng thích hợp cho mỗi loại ở 40C hoặc ở 200C. Trước khi sử dụng, các vi khuẩn được hoạt hoá trên môi trường dịch thể, nuôi lắc các ống nghiệm trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ, sau đó cấy trải trên môi trường thạch đĩa để
tạo thành những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cấy truyền sang ống nghiệm chứa các môi trường thạch. Sử dụng giống đã được hoạt hoá cho những nghiên cứu tiếp theo.
- Đối với nấm mốc: Để có thể hoạt hoá nấm mốc phương pháp làm tương tự như đối với các vi khuẩn nhưng môi trường sử dụng là môi trường MT1 và MT3.
2.2.1.2 Phương pháp lên men bề mặt [24]
Môi trường cơ chất bã sắn đã được làm ẩm đến 75% bằng dịch khoáng và được thanh trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút. Để nguội, bổ sung A. oryzae NM1 và trộn đều nhằm phõn tán bào tử trong sinh khối lên men. Hỗn
hợp cơ chõt - giống được ủ trong 36h ở điều kiện 330C.
2.2.2 Phương pháp hoá sinh
2.2.2.1 Xác định khả năng sinh enzyme (amylase, cellulase, chitinase, protease) bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch. protease) bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Dựa theo phương pháp của Williams, (1983) [14, 59].
* Chuẩn bị cơ chất cho từng loại enzyme: Môi trường gồm 2% thạch có bổ sung 1% tinh bột tan hoặc 1% chitin hoặc 0.5% CMC hoặc 1% gelatin. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 25ml sau đó để nguội.
* Chuẩn bị dịch thử enzyme: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính.
* Thử hoạt tính: Dùng khoan nút chai khoan 2 lỗ trên đĩa thạch. Nhỏ 100àl dịch trong thu được vào mỗi lỗ. Đặt vào tủ lạnh 40
C từ 8 -12h để enzyme khuếch tán vào thạch, sau đó chuyển sang tủ ấm 300C khoảng 24h. Hoạt tính enzyme được hiện hình bằng vòng phân giải khi sử dụng các thuốc thử tương ứng. Hoạt tớnh Amylase và chitinase được hiện hình bằng
dung dịch lugol (1g KI với 2g I2 trong 300ml nước). Hoạt tớnh cellulase được hiện hình bằng dung dịch công gô đỏ 1%. Hoạt tớnh Protease được hiện hình bằng dung dịch Amonisunfat bóo hoà. Hoạt tớnh các enzyme được đánh giá sơ bộ bằng độ lớn vòng phõn giải (D-d, mm), trong đó D là đường kớnh vòng phõn giải, d là đường kớnh lỗ thạch.
2.2.2.2 Xác định hoạt độ cacboxymethylcellulase và amylase
Dựa theo phương pháp của Miller G.L. (1959) [49].
* Nguyên lý: CMC-ase phõn cắt cacboxymethylcellulase (CMC) và amylase phõn cắt tinh bột thành các oligosaccharide và glucose có tớnh khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
* Tiến hành thí nghiệm:
+Pha dung dịch cơ chất: dung dịch 0,5% CMC hoặc dung dịch 1% tinh bột ngô trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.
+ Dung dịch thuốc thử DNS: Hoà tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, sau đó thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H2O, 10g DNS, khuấy đều cho cỏc hoỏ chất tan hoàn toàn. Bổ sung thêm nước cất để đạt 1000 ml.
+ Dựng đường chuẩn D-glucose: Pha dung dịch gốc 10μmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 10 (μmol/ml). Lấy 50μl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450μl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm.
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-1)
y = 15.759x + 0.5181 R2 = 0.9912 0 2 4 6 8 10 12 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 A540nm N ồ n g đ ộ D -g lu co se ( m ic ro m o l/m l) Series1 Linear (Series1)
Hình 2-1. Đường chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm thu được là y=15,759x + 0,15181. Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
+ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của CMC-ase và amylase:
- Thí nghiệm: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750μl dung dịch DNS để dừng phản ứng
- Đối chứng: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dung dịch DNS + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút.
Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5-7 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm. Từ giá trị OD ta tớnh được lượng đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình
y=15,759x + 0,15181 (trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x
là giá trị OD540nm tương ứng).
Quy ước: Một đơn vị hoạt tớnh (IU) của CMC-ase (hoặc amylase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol đường khử trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm dùng glucose là đường chuẩn.
2.2.2.3 Xác định hoạt độ xylanase
Dựa theo phương pháp của Bailey (1992) [31].
* Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4- xylanase) phõn cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và các xylose có tớnh khử, có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
* Tiến hành thí nghiệm:
+ Dung dịch cơ chất 1% oat spelts xylan (OSX): Cõn 1gam OSX pha trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.
+ Dung dịch thuốc thử DNS được pha như đã trình bày ở trên.
+ Dựng đường chuẩn D-xylose: Pha dung dịch gốc 10àmol/ml D- xylose trong đệm Na-acetat 50mM. Từ đó pha loãng thành các nồng độ (àmol/ml): 0; 2; 4; 6; 8 ;10. Dựng 50àl dịch D-xylose ở các nồng độ + 450 àl dung dịch 1% oat spelts xylan (OSX) + 750àl dịch thử DNS. Đun cách thủy 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng và đo độ hấp phụ OD ở bước sóng λ540nm ta được giá trị tương ứng.
Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D- xylose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-2)
y = 11.653x + 0.197 R2 = 0.995 0 2 4 6 8 10 12 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A540nm N ồ n g đ ộ x y lo s e (m ic ro m o l/m l) Series1 Linear (Series1)
Hình 2-2. Đường chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS)
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-xylose và giá trị OD540nm thu được là y=11.653x+0.197. Trong đó: y là hàm lượng D-
xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của xylanase
+ Thí nghiệm: 450àl dung dịch 1% OSX+ 50àl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500
C trong 5 phút, bổ sung 750àl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
+ Đối chứng: 450àl dung dịch 1% OSX+ 750àl dung dịch DNS+ 50àl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 5 phút.
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng trong 5 đến 7 phút, sau đó cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 540nm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ phương trình
y=11.653x+0.197 (trong đó: y là hàm lượng D-xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng).
Qui ước: Một đơn vị hoạt độ xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 àmol đường khử trong một phút ở điều kiện thí nghiệm dùng xylose là đường chuẩn.
2.2.2.4 Hoạt tính Protease
Dựa theo phương pháp của: Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) [58]. * Nguyên lý: Dựa trên sự bắt màu xanh tớm đặc trưng của amino acid khi có mặt của thuốc thử Folin-Ciocalteu,s Phenol, hấp thụ tốt nhất ở bước sóng 660nm.
* Tiến hành thí nghiệm: + Chuẩn bị hoá chất:
1. Đệm Phosphate 50mM, pH=7.5
2. Dung dịch casein 0,65% trong 50mM đệm Phosphate: Cân 0,65g casein vào 100ml dung dịch đệm trên, đun nóng nhẹ đến 80-900
C trong 10 phút và khuấy cho tan (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 1M và HCl 1M).
3. Axit tricloacetic 110mM. Pha dung dịch TCA 6,1N (9,967g TCA/10ml nước cất siêu sạch), lấy 9ml TCA 6,1N pha với nước siêu sạch thành 500ml. 4. Dung dịch thuốc thử Folin và Ciocateu,
s phenol. Pha loãng Folin và Ciocateu,s phenol với nước cất siêu sạch theo tỉ lệ 1:3.
5. Na2CO3 500mM : Cân 53g Na2CO3 trong 1000ml nước siêu sạch
6. Đệm acetat natri 10mM, acetat canxi 5mM: Cân 0,82g acetat natri +0,79 acetat canxi trong 1000ml nước siêu sạch (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 0,1M, CH3COOH 0,1M).
7. L-Tyrosine 1μmol/ml: cõn 1,81mg tyrosine pha trong 10ml nước siêu sạch, dùng máy khuấy từ khuấy đều cho tan.
+ Dựng đường chuẩn L-Tyrosine: Pha dung dịch gốc 1μmol/ml L-Tyrosine trong đệm 50mM Phosphate. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0.01; 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.1; 0.12; 0.14; 0.16; 0.18; 0.2 (μmol/ml). Lấy 400μl Tyrosine + 1000μl Na2CO3 + 200μl Folin. Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đo ở bước sóng λ660nm.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ L-Tyrosine và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-3)
Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine y = 0.3536x - 0.0018 R2 = 0.9971 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.2 0.4 0.6 A 660 H àm l ư ợ ng Ty ros ine (m ic rom ol ) Hàm lượng Tyrosine Linear (Hàm lượng Tyrosine)
Hình 2-3. Đường chuẩn thể hiện mối tương giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng L-Tyrosine và giá trị OD660nm thu được là y=0.3536-0.0018. Trong đó: y là hàm lượng L-
Tyrosine trong 1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9971 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của Protease:
+ Thí nghiệm: 250μl dung dịch 0,65% casein + 50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút, bổ sung 250àl dung dịch TCA để dừng phản ứng.
+ Đối chứng: 250μl dung dịch 0,65% casein + 250àl dung dịch TCA +50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút.
Li tâm mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng 10000 v/phỳt trong 5 phút. Lấy 400μl dịch li tâm + 1ml Na2CO3 500mM + 200μl Folin. Ủ 5-10phút, đo OD660. Từ giá trị OD ta tính được lượng enzyme (IU/ml) được tạo ra nhờ phương trình y=0.3536-0.0018 (trong đó: y là hàm lượng L-Tyrosine trong
1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng).
Qui ước: : Một đơn vị hoạt tính protease (IU) là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 àmol acid amin (tớnh theo L-Tyrosine) trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
2.2.2.5 Xác định hoạt tính kháng sinh
Dựa theo phương pháp của Egorov et al., (1969).
* Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định: Nuụi cỏc vi sinh vật kiểm định B.
subtilis, E.coli, Staphyllococcus sp., S. aureus 7YB, S. enteritidis, S.
typhymurium trên môi trường MPA dịch thể.
* Chuẩn bị dịch trích ly từ hệ sợi của nấm: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính.
* Thử hoạt tớnh kháng sinh: Trộn vi sinh vật kiểm định vào môi trường MPA thạch nóng chảy ở 40- 500
C, đổ vào đĩa petri, để nguội. Dùng khoan nút chai (= 8mm) khoan 4 lỗ trên đĩa thạch. Nhỏ 100àl dịch trích ly
từ hệ sợi của nấm vào lỗ thạch. Để đĩa petri vào tủ lạnh 40
C từ 8h-12h cho dịch nấm khuếch tán vào thạch, sau đó nuôi trong tủ ấm 300
C trong 24h. Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng độ lớn vòng vô khuẩn (D-d, mm), trong đó D là đường kớnh vòng vô khuẩn, d là đường kớnh lỗ thạch.
2.2.2.6 Phương pháp xác định Protein tổng số
Dựa theo phương pháp của Bradford (1976) [34]
*Nguyên lý: Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt của dịch nhuộm Bradford (thành phần chớnh là Coomassie Brilliant Blue G- 250 (CBB-250) có tớnh bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt các phõn tử protein cần phõn tích. Các phõn tử thuốc thử có chứa 6 nhúm phenyl và 2 nhúm acid sulfuric. Do đó, các tương tác chủ yếu xảy ra với các đuôi kị nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện õm (arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hoá trị.
* Tiến hành thí nghiệm:
- Dung dịch Bradford: Pha 50mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 25ml dung dịch 95% ethanol, bổ sung thêm 50 ml dung dịch 85% H3PO4 (w/v). Rót dung dịch trên vào bình chứa và bổ sung thêm nước khử ion cho đến khi đạt 500ml thì dừng lại, lọc qua giấy lọc Whatman và giữ trong lọ màu ở tủ lạnh 40
C.
- Dung dịch BSA (1mg/ml): Pha dung dịch BSA trong nước khử ion, giữ trong điều kiện lạnh âm để bảo quản.
- Tiến hành dựng đường chuẩn BSA
- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thuốc thử như hướng dẫn nêu trên
- Bước 2: Chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,1mg/ml bằng cách pha loãng 10 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O khử ion.
Mẫu thử Thể tích dung dịch BSA (μl) Thể tích H20 μl Thể tích thuốc thử Braford (μl) 0 0 100 1000 0,1 10 90 1000 0,2 20 80 1000 0,3 30 70 1000 0,4 40 60 1000 0,5 50 50 1000 0,6 60 40 1000 0,7 70 30 1000 0,8 80 20 1000 0,9 90 10 1000 1,0 100 0 1000
- Bước 4: Ủ trong điều kiện phòng 15- 20 phút
- Bước 5: Đo độ hấp thụ ở 595 trên máy quang phổ Photometric UV.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ BSA (μg/ml) và giá trị OD595 được xõy dựng trên chương trình Microsoft Excel (Hình 2-4).
y = 23.184x - 0.4094 R2 = 0.9944 -2 0 2 4 6 8 10 12 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 A595 N ồ n g đ ộ B S A ( m ic ro g am /m l) Hình 2-4. Đồ thị chuẩn BSA
Từ đồ thị trên ta có phương trình đường chuẩn y= 23,184x-0,4094, với
y là lượng BSA có trong 1ml dịch, x là giá trị OD595 tương ứng. Hệ số tương quan R2=0,9944 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ.
- Thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy 100μl dung dịch protờin cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm 1000μl thuốc thử Bradford. Ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở 595nm. Hàm lượng protờin được xác định theo phương trình y= 23,184x-0,4094 ở trên.
2.2.2.7 Phương pháp xác định lượng đường tổng số
Dựa theo phương pháp phenol-acid-sulfuric của Dubois và cs. (1956) [47]. * Nguyên lý: Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các ete methyl) không hoặc có các nhúm có tớnh khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
* Tiến hành thí nghiệm
- Dung dịch 5% phenol: Làm tan phenol ở 500C và bổ sung 5ml phenol lỏng vào 95ml H2O.
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Dung dịch gốc 10àmol/ml D-xylose, sau đó pha loóng thành các nồng độ 0,2 đến 2,0 àmol/ml.
- Tiến hành dựng đường chuẩn D-xylose: Lấy 0,5ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5ml dung dịch 5% phenol, 2,5ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Đo ở bước sóng 490nm thu được các giá trị OD tương ứng.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Excel (Hình 2-5)
y = 2.4881x + 0.0016 R2 = 0.9984 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A490nm N ồ n g đ ộ x yl