Dựa theo phương pháp của Bailey (1992) [31].
* Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4- xylanase) phõn cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và các xylose có tớnh khử, có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
* Tiến hành thí nghiệm:
+ Dung dịch cơ chất 1% oat spelts xylan (OSX): Cõn 1gam OSX pha trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.
+ Dung dịch thuốc thử DNS được pha như đã trình bày ở trên.
+ Dựng đường chuẩn D-xylose: Pha dung dịch gốc 10àmol/ml D- xylose trong đệm Na-acetat 50mM. Từ đó pha loãng thành các nồng độ (àmol/ml): 0; 2; 4; 6; 8 ;10. Dựng 50àl dịch D-xylose ở các nồng độ + 450 àl dung dịch 1% oat spelts xylan (OSX) + 750àl dịch thử DNS. Đun cách thủy 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng và đo độ hấp phụ OD ở bước sóng λ540nm ta được giá trị tương ứng.
Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D- xylose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-2)
y = 11.653x + 0.197 R2 = 0.995 0 2 4 6 8 10 12 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A540nm N ồ n g đ ộ x y lo s e (m ic ro m o l/m l) Series1 Linear (Series1)
Hình 2-2. Đường chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS)
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-xylose và giá trị OD540nm thu được là y=11.653x+0.197. Trong đó: y là hàm lượng D-
xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của xylanase
+ Thí nghiệm: 450àl dung dịch 1% OSX+ 50àl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500
C trong 5 phút, bổ sung 750àl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
+ Đối chứng: 450àl dung dịch 1% OSX+ 750àl dung dịch DNS+ 50àl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 5 phút.
Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng trong 5 đến 7 phút, sau đó cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 540nm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ phương trình
y=11.653x+0.197 (trong đó: y là hàm lượng D-xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng).
Qui ước: Một đơn vị hoạt độ xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 àmol đường khử trong một phút ở điều kiện thí nghiệm dùng xylose là đường chuẩn.