Một đoạn DNA được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu hình giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài được gọi là phương pháp chỉ thị phân tử đánh dấu gen.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Hiện nay có rất nhiều cách đánh dấu phân tử như sựđa hình về các isozym, protein và DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phát hiện gene kháng bệnh thối thân thối rễ. Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần có những yêu cầu như: bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử - dị hợp tử), phân biệt rõ ràng giữa các alen, xuất hiện nhiều trong genome (tần suất xuất hiện trong hệ genome cao), phân bố đều trên hệ genome, dễ dàng tiếp cận đánh giá, trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gene), phân tích nhanh và dễ dàng, khả năng tái lập cao, kết quả trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu, chi phí thấp. Trong thực tế, không có một chỉ thị phân tử ADN nào lý tưởng, đạt được đầy đủ những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phân tử ADN thỏa mãn một sốđiều kiện chính.
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989. Vi vệ tinh là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người, sau đó đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo & Sebatian, 1998). Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp DNA có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn. Các ‘vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật. Vùng có DNA lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau. Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác. Chỉ thị SSR là chỉ thịđồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn. Đây là loại chỉ thị đang được sử dụng nhiều trong lập bản đồ gene, trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn giống MAS. Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém. SSR là chỉ thịđồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 cho một loài. Tuy nhiên, SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gene trong chọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gene, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ allen thuộc một locus.
Trong số các biện pháp phòng trừ tác hại ảnh hưởng của bệnh thối thân thối rễ thì việc sử dụng các giống kháng ngày càng được quan tâm nhiều hơn, việc lựa chọn gene kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh và tính độc của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử phát hiện ra nguồn gene kháng thối thân thối rễ. Các nhà khoa học đã tìm được vị trí các gene được định vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gene đó, tạo ra các bản đồ di truyền liên kết gene. Dựa vào các chỉ thị này, chúng ta có thể phát hiện được sự có mặt của một gene bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thị liên kết chặt với gene đó. Cho đến nay, 14 gene Rpsđã được xác định và lập bản đồ (Sandhu et al., 2005). Gene Rps1 và gene Rps3 là hai gene kháng thối thân thối rễ quan trọng, có tính kháng cao. Các locus gene Rps1
phức tạp. Nó có năm allene chức năng bao gồm Rps1,a,b,c,d,k và được liên kết với
Rps7 (Sandhu et al., 2005), gene Rps1-kđã được sử dụng rộng rãi nhất trong tạo các giống đậu tương chống chịu Phytophthora sojae khoảng hai thập kỷ và nó vẫn đang được sử dụng và phát triển trong nhiều lĩnh vực của đậu tương (Sandhu et al., 2005). Gene Rps1được xác định nằm ở nhiễm sắc thể số III, gần vị trí 28 cM trên bản đồ ở nhóm liên kết phân tử N của bản đồ gene đậu tương (Sandhu et al., 2005). Gene này được định vị giữa marker Sat_186 và Satt530, có khả năng kháng được nhiều chủng đặc hiệu nấm Phytophthora sojae. Marker Satt530 đã được sử dụng để phát hiện gen Rps1 với kích thước sản phẩm là 200bp (Sugimoto et al., 2011). Gene
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Rps3 gồm ba allene chức là Rps3a,b,c liên kết phân tử F của bản đồ gene đậu tương trên NST XIII (Demirbas và et al.,2001, Sandhu và et al., 2005). Marker Satt114 đã được sử dụng để phát hiện gen Rps3 với kích thước sản phẩm là 109bp (Demirbas và et al., 2001).
Trong nghiên cứu các giống đậu tương kháng bệnh thối thân thối rễ trên thế giới đang được quan tâm nhiều nhất là ở các nước như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Iran. Ở Nhật Bản có hai giống cây trồng “Hayagin-1” và “KLS733-1” đó là giống có khả năng kháng tất cả 10 pathotypes từ Hokkaido, đã được chọn là giống kháng bệnh thối thân thối rễ trong nhân giống đậu tương ở nước này (Sugimoto et al., 2012). Cho đến nay việc nghiên cứu các giống đậu tương kháng bệnh thối thân thối rễ bằng chỉ thị phân tử DNA ở Việt Nam chưa được công bố và tìm hiểu nhiều.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đậu tương đối chứng DT 96.
- 100 mẫu giống đậu tương nhập nội (kí hiệu, tên, xuất xứ các mẫu giống được trình bày Phụ lục 1).