a. Chiết tách DNA
DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle & Doyle, 1990)
- Hóa chất và đệm:
+ DEB (DNA Extraction Buffer): 4% CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v). Hòa tan CTAB và các hóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65ºC.
+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH=8.
+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol.
- Qui trình chiết xuất DNA:
Tiến hành cắt vào lúc sáng sớm, chọn những lá còn non, không bị sâu bệnh bỏ vào ống nghiệm, đánh dấu tên giống rồi đặt vào đá lạnh.
Trong phòng thí nghiệm, các cối chày sứ đã được hấp khử trùng và đặt trên đá lạnh.
1.Các mẫu lá được cắt nhỏ rồi bỏ trong cối sứ.
2.Nhỏ 400 µl DEB vào chối chày sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá.
3.Thêm 300 µl DEB và trộn đều trước khi chuyển hỗn hợp vào tube 1,5 ml. Ủ mẫu ở 65ºC trong 30 phút.
4.Thêm 700 µl 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược các ống trong 5 phút, sau đó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 12000 rpm để phân tách các pha, chuyển pha lỏng phía trên sang một tube 1,5 ml mới.
5.Chiết với cùng thể tích 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa tuble trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 12000 rpm, chuyển pha lỏng phía trên sang 1 tube mới.
6.Tủa DNA với 2,5 lần thể ethanol lạnh 100%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì đặt mẫu ở -20C trong khoảng 20’ đến 2 tiếng hoặc qua đêm nếu thấy cần thiết.
7.Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tốc độ 12000 rpm. 8.Đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. Làm khô pellet trong không khí khoảng 1h và hòa tan trong 50 µl TE.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 9.Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 15 phút. Độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức độđứt gãy và nồng độ DNA tổng số.
b. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng Rps1 và Rps3
Tiến hành phản ứng PCR
- Chuẩn bị DNA của các mẫu giống nghiên cứu.
- Thành phần 20µl dung dịch phản ứng PCR gồm: 10µl PCR master mix, 1µl Primer Forward, 1µl Primer Revese, 7µl H20, 1µl DNA mẫu.
- Các mồi sử dụng để phát hiện ra gen kháng bệnh thối thân Rps1 và Rps3 Marker Gen Trình tự mồi Tác giả Satt530 Rps1 F CATGCATATTGACTTCATTATT R CCAAGCGGGTGAAGAGGTTTTT Sugimoto và et al., 2011 Satt114 Rps3 F GGGTTATCCTCCCCAATA R ATATGGGATGATAAGGTGAAA Demirbas và et al, 2001
- Chu trình nhiệt cho marker Satt530: 940C/4 phút, 35 chu kỳ (940C/1 phút, 520C/1 phút, 720C/1 phút) ,720C/5 phút.
- Chu trình nhiệt cho marker Satt114: 940C/4 phút, 35 chu kỳ (940C/1 phút, 550C/1 phút, 720C/1 phút) ,720C/5 phút.
c. Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽđược chạy điện di để phát hiện gen kháng.
-Chuẩn bị gel agarose 1,5%. -Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V.
-Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng Ethidium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
-Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di để xem có gen kháng hay không. Kết quả mẫu giống có chứa gen Rps1 sẽ xuất hiện một vạch có kích thước 200bp, mẫu giống có chứa gen thơm Rps3 sẽ xuất hiện một vạch có kích thước 109bp và các mẫu giống không chứa gen sẽ không có vạch nhân lên.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN