PHẦN IV KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm
4.2.1Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùnglặp lại thuộc ORF94 1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần
4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần
Thị Mỹ Duyên, (2006)
Theo Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) thực hiện phản ứng PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV theo thành phần hoá chất phản ứng với thể tích 50^l thì cho kết quả tối ưu và đã được Lê Vân Hải Yến và Triệu Thanh Tuấn, (2006) ứng dụng để xác định vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên các mẫu tôm sú thu tại Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Tuy nhiên có sự thay đổi thể tích của phản ứng từ 50 ^l thành 25 ^l. Cụ thể, đề tài thực hiện qui trình PCR-genotyping (ORF94) theo thành phần phản ứng PCR Buffer (1 X), MgCl2 (1,5 mM), dNTP (200 ^M), mix ORF94-R (25 pmol), ORF94-F (25 pmol), DNA mẫu (200 pmol) với tổng thể tích là 25 ^l. Trong nghiên cứu này khi thực hiện phản ứng khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 thì nồng độ hoá chất không
đổi nhưng giảm thể tích hoá chất xuống V tức là thể tích của phản ứng còn 25^l thì vẫn cho kết quả tốt.
Để kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình sau khi giảm thể tích, nghiên cứu đã tiến hành thực hiện thử phản ứng với 10 mẫu dương tính với WSSV trong đó có 3 mẫu nhiễm nhẹ (+), 3 mẫu nhiễm trung bình (++), 4 mẫu nhiễm nặng (+++)
Bảng 4.2: Cường độ nhiễm của 10 mẫu kiểm tra Thứ tự điện di Mẫu phân tích Cường độ nhiễm
1 3a (+) 2 3d (+) 3 3e (+) 4 3c (++) 5 4b (++) 6 4c (++) 7 11c (+++) 8 11d (+++) 9 11e (+++) 10 12e (+++)
Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra 10 mẫu sau khi giảm thể tích. Giếng M: Thang DNA 1kb plus.
Giếng 1, 2, 3 mẫu nhiễm nhẹ (+). Giếng 4, 5, 6 mẫu nhiễm trung bình (++). Giếng 7, 8, 9, 10 mẫu nhiễm nặng (+++)
Dựa vào kết quả chạy điện di cho thấy các mẫu có kích thước sản phẩm khác nhau. Các mẫu 3a, 3c, 3d, 3e, có kích thước 453 bp tương ứng với 5 vùng lặp lại, và các mẫu 11c, 11d, 11e có cùng kích thước 615 bp ứng với 8 vùng lặp lại. Mẫu 4b có 10 vùng lặp lại với kích thước 723 bp, trong khi đó mẫu 4c lại có 5 vùng lặp
lại. Đặc biệt là mẫu 12e có hai vạch DNA có kích thước là 399 bp, và 561 bp ứng với số vùng lặp lại là 4 và 7. Kết quả kiểm tra cho thấy cả 10 mẫu cho kết quả rõ ràng các vạch DNA sáng và rõ nét, kể cả những mẫu có 2 vạch DNA tương ứng với hai vùng lặp lại. Như vậy có thể sử dụng rộng rãi qui trình này để xác định vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV vì nó cho kết quả tốt mà còn giảm giá thành của phản ứng.