a. Đặc tính nuôi cấy
- Xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Bacillus subtilis theo
phương pháp thường quy ở phòng thí nghiệm:
+ Ria cấy mẫu trên môi trường thạch nghiêng TSA, để tủ ấm 37oC trong
24h, lấy ra kiểm tra thấy Bacillus subtilis mọc trên môi trường có khuẩn lạc màu
xám nhạt, rìa nhăn gợn sóng, xù xì, bề mặt khô thì ta lấy 1 khuẩn lạc đặc trưng
cấy lên môi trường thạch đĩa TSA, nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy đem quan sát tính chất mọc của vi khuẩn Bacillus
subtilis trên môi trường TSA.
+ Tiếp tục lấy khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA để nhuộm Gram quan sát đặc điểm hình thái, thử các phản ứng sinh hóa như TSI, IMViC và nuôi
cấy trên môi trường thạch khoai tây nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ quan sát
hình thái, màu sắc khuẩn lạc. b. Đặc tính sinh hóa
Thực hiện các phản ứng sinh hóa: + Phản ứng Catalaza
+ Phản ứng Indol + Lên men Glucose + Phản ứng Methyl Red + Phản ứng Voges Prokauer + Phản ứng Citrate
+ Lên men Manitol
3.3.3. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen Bacillus subtilis
Lưu giữ giống vi khuẩn Bacillus subtilis ở các nhiệt độ khác nhau dựa vào
a. Phương pháp lạnh đông + Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
+ Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt
nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
+ Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0,05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc
độ lạnh dao động 1-3oC/phút để đạt tới nhiệt độ -30oC ban đầu. Sau đó mẫu
được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15oC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần
thiết (-100oC đến -80oC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương
trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65oC.
Thông thường giữ vi khuẩn ở nhiệt độ -20oC, 6 tháng kiểm tra và chuyển
giống một lần.
+ Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá
bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37oC
trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.
b. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) + Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
+ Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau: Đệm huyết thanh- inositol:
Meso-inositol: 5 g
Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.
Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2,5 g Meso-inositol: 5 g
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121oC.
+ Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt
1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi
sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteriaceae thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn.
+ Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh
+ Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0,1- 0,2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.
+ Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.
+ Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.
+ Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.
+ Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.
+ Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm.
+ Kiểm tra khả năng sống của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước
kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại Gram (+) cao hơn vi sinh vật Gram (-). Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí th́ì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy.
+ Bảo quản mẫu: Giữ giống vi khuẩn ở nhiệt độ 2 – 8oC. Mẫu thông
thường được bảo quản tại 4oC hay nhiệt độ phòng.