đông và đông khô
Bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn đảm bảo được tính chất của giống, duy trì gần như nguyên vẹn đặc tính ban đầu của giống vi khuẩn, trước lúc cất giữ, đủ tiêu chuẩn cho quá trình sản xuất. Bằng cách làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của vi khuẩn, đồng thời ngăn cản sự sinh sản của chúng.
Để lưu giữ được giống, cần thuần hóa giống, có nghĩa là chọn chủng vi khuần ở điều kiện và giai đoạn tối ưu cho bảo quản, và chọn phương pháp thích hợp cho lưu giữ.
Hiện nay có nhiều phương pháp để giữ giống vi khuẩn, tuỳ theo điều kiện mà chúng ta có thể chọn phương pháp thích hợp. Giữ giống bằng phương pháp thích hợp có thể duy trì được những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá giống, mất hoạt tính. Ngoài hai phương pháp lưu giữ có hiệu quả và tối ưu là lạnh đông và đông khô thì vẫn còn các phương pháp giữ giống vi khuẩn khác như giữ giống trên môi trường thạch nghiêng định kỳ kiểm tra cấy truyền…
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Sau đó các chủng vi khuẩn này được chuyển đến nơi lưu giữ có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Ngoài các chủng của vi khuẩn
Bacillus subtilis thì trên thực tế có nhiều chủng vi khuẩn thích hợp với phương
pháp lưu giữ này như: Staphylococcus, E.coli.. có thể sống được vài năm theo
cách này.
Các ống được lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-6oC. Định kỳ cấy truyền
vật khác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng.
Để công tác giữ giống được tốt, lâu hơn và đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên môi trường đã được cấy giống vi khuẩn một lớp dầu khoáng như parafin lỏng. Lớp parafin nầy sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi khuẩn đối với oxy không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do vậy giống có thể được bảo quản lâu hơn và ít bị nhiễm tạp, thối hóa.
Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
• Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
• Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữ các chủng trong quá trình bảo quản.
• Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp với các chủng
bảo quản.
• Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
• Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không
thích hợp.
• Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do
đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.
Bảo quản trên gelatin
Rất nhiều vi sinh vật được giữ giống trên gelatin, đây là phương pháp dễ làm và an toàn được công bố năm 1947 và ngày càng phổ biến rất rộng rãi. Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi khuẩn trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm. Sau đây là hai cách giữ giống:
Bảng 2.3. Cách bảo quản giống trên môi trường gelatin Các bước tiến hành Cách A (Kirsop,B.and Snell.J.J.S) Cách B
(theo Norris,J.R and Ribbons.D.V) Chuẩn bị môi
trường gelatin
Môi trường nước thịt + 10% gelatin + 5% Inosit
Môi trường nước thịt + 10% gelatin + 0,25 axit ascorbic
Chuẩn bị giống
Trộn tế bào đã chuẩn bị trước vào gelatin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuôi vi sinh vật trên môi trường
gelatin đến 1x1010/ ml
Phân làm các miếng nhỏ
gelatin
Cho môi trường gelatin đã có vi sinh vật từng giọt lên đĩa petri vô trùng
Dùng micropipet nhỏ từng giọt lên miếng giấy nến trên các đĩa petri
Sấy khô Sấy trong tủ hút chân không,
dùng P2O5hấp thu nước
Sấy trong tủ hút chân không, dùng P2O5 hấp thu nước
Bảo quản Trong ống nghiệm ở +5oC Trong ống nghiệm ở +5oC
Sử dụng
Lấy gelatin cho vào 1ml môi trường lỏng thích hợp nuôi ở
37o, 24h, sau đó cấy vào môi
trường agar, chọn khuẩn lạc điển hình
Lấy gelatin cho vào 1ml môi
trường lỏng thích hợp nuôi ở 37o,
24h, sau đó cấy vào môi trường agar, chọn khuẩn lạc điển hình
Phương pháp giữ trong lạnh
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi khuẩn,
đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu ở khoảng -20oC đến -80oC. Người ta trộn vi
khuẩn với dung dịch bảo vệ hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá như glycerin 15%, huyết thanh ngựa (loại không có chất bảo quản), dung dịch glucozơ hoặc lactozơ
10%..., việc làm lạnh được tiến hành một cách từ từ. Khi nhiệt độ đạt -20oC nếu
tiếp tục làm lạnh thì phải ở tốc độ 1-2oC/phút.
Thời gian cấy chuyển định kỳ:
• Giữ ở nhiệt độ -30oC thì 9 tháng cấy truyền lại 1 lần
• Giữ ở nhiệt độ -40oC thì 12 tháng cấy truyền lại 1 lần
• Giữ ở nhiệt độ -50oC thì 3 năm cấy truyền lại 1 lần
• Giữ ở nhiệt độ ≥ -70oC thì 10 năm cấy truyền lại 1 lần
Phương pháp này có ưu điểm là bảo quản được lâu, đạt hiệu quả cao và hiện nay được sử dụng rất phổ biến.
Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi khuẩn và bảo quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture) của Vương quốc Anh.
Phương pháp cũng dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi khuẩn và đưa chúng vào điều kiện lạnh khô. Người ta trộn vi khuẩn với chất bảo vệ như:
+ glutamat 3%
+ lactoze 1,2%+pepton 1,2%
+ saccaroze 8%+sữa 5%+ gelatin,5%
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi khuẩn được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.
Đây là phương pháp giữ giống tối ưu nhất, có thể giữ giống hàng chục năm với tỷ lệ sống cao, không bị biến tính và chiếm ít diện tích lưu giữ giống. Là phương pháp có hiệu quả cao cho lưu giữ vi khuẩn và các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, một số virus.
2.3.3. Vai trò, ý nghĩa của bảo tồn, lưu giữ giống vi khuẩn
Việc bảo tồn, lưu giữ giống phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sinh học và công nghệ sinh học để tạo ra các sản phẩm đa dạng phục vụ cho đời sống.
Bảo tồn, lưu giữ vi khuẩn ở trạng thái sống, thuần khiết và ổn định là việc làm khó khăn vì chủng vi khuẩn có các đặc điểm sinh học riêng và các đặc điểm này có thể thay đổi theo thời gian bảo tồn do sự biến tính hay xâm nhập của các vi sinh vật lạ. Vì vậy, việc lưu giữ giống ổn định, bảo toàn tất cả các đặc tính sinh học của vi khuẩn trong suốt thời gian bảo tồn là vấn đề cấp thiết hiện nay.
PHẦN III
NỘI DUNG – NGUYÊN VẬT LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG
3.1.1. Đánh giá sự ổn định về số lượng và mức độ an toàn của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn. khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn.
3.1.2. Đánh giá sự ổn định về đặc tính nuôi cấy và một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn. của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn.
3.1.3. Bảo tồn và lưu giữ nguồn genBacillus subtilis
3.2. NGUYÊN LIỆU
3.2.1. Môi trường, hóa chất
- Sử dụng các loại môi trường đặc trưng của hãng Merk, Đức: Nước thịt, TSA, TSI, TSB+ 15% Glyceril, BHI
- Nước sinh lý 0,9% - Thạch khoai tây
- Môi trường Sabouraul - Thuốc thử Methyl Red - Thuốc thử Kovacs
- Dung dịch Hydrogen peroxide (H2O2)
3.2.2. Trang thiết bị
Các máy móc thông dụng trong phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y: nồi hấp ướt, buồng cấy, tủ sấy, máy khuấy từ gia nhiệt, tủ lạnh, tủ ấm, máy li tâm, tủ lạnh âm, máy voltex.
3.2.3. Vi khuẩn
Các ống vi khuẩn Bacillus subtilis đang được bảo tồn tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp đánh giá sự ổn định về số lượng và mức độ an toàn của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn
a. Phương pháp kiểm tra số lượng của vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn.
- Từ các ống vi khuẩn Bacillus subtilis tiến hành pha loãng thành các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8
- Cấy mẫu ở các nồng độ trên lên môi trường TSA rồi cho vào tủ ấm 37oC
trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ chúng ta quan sát và đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA - Tính số lượng vi khuẩn: Tổng số vi khuẩn (CFU/ml) = d n n V C ) 1 , 0 ( 1 + 2 ∑ Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ở 2 độ pha loãng liên tiếp
V: thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml)
n1: số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được chọn để đếm số khuẩn lạc
n2: số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được chọn để đếm số khuẩn lạc
d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
b. Phương pháp kiểm tra ô nhiễm nấm của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn.
Pha loãng mẫu sau đó cấy vào môi trường Sabouraul nuôi cấy trong tủ ấm
3.3.2. Phương pháp đánh giá sự ổn định về đặc tính nuôi cấy và đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn hóa của Bacillus subtilis sau thời gian bảo tồn
a. Đặc tính nuôi cấy
- Xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Bacillus subtilis theo
phương pháp thường quy ở phòng thí nghiệm:
+ Ria cấy mẫu trên môi trường thạch nghiêng TSA, để tủ ấm 37oC trong
24h, lấy ra kiểm tra thấy Bacillus subtilis mọc trên môi trường có khuẩn lạc màu
xám nhạt, rìa nhăn gợn sóng, xù xì, bề mặt khô thì ta lấy 1 khuẩn lạc đặc trưng
cấy lên môi trường thạch đĩa TSA, nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy đem quan sát tính chất mọc của vi khuẩn Bacillus
subtilis trên môi trường TSA.
+ Tiếp tục lấy khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA để nhuộm Gram quan sát đặc điểm hình thái, thử các phản ứng sinh hóa như TSI, IMViC và nuôi
cấy trên môi trường thạch khoai tây nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ quan sát
hình thái, màu sắc khuẩn lạc. b. Đặc tính sinh hóa
Thực hiện các phản ứng sinh hóa: + Phản ứng Catalaza
+ Phản ứng Indol + Lên men Glucose + Phản ứng Methyl Red + Phản ứng Voges Prokauer + Phản ứng Citrate
+ Lên men Manitol
3.3.3. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen Bacillus subtilis
Lưu giữ giống vi khuẩn Bacillus subtilis ở các nhiệt độ khác nhau dựa vào
a. Phương pháp lạnh đông + Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
+ Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt
nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
+ Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0,05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc
độ lạnh dao động 1-3oC/phút để đạt tới nhiệt độ -30oC ban đầu. Sau đó mẫu
được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15oC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần
thiết (-100oC đến -80oC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương
trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65oC.
Thông thường giữ vi khuẩn ở nhiệt độ -20oC, 6 tháng kiểm tra và chuyển
giống một lần.
+ Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá
bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37oC
trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.
b. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) + Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
+ Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau: Đệm huyết thanh- inositol:
Meso-inositol: 5 g
Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.
Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2,5 g Meso-inositol: 5 g
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121oC.
+ Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt
1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi
sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteriaceae thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh
+ Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0,1- 0,2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.
+ Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.
+ Tạo chỗ thắt trên ống đông khô: