ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6.1. Tách DNA, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang bằng máy NanoDrop 1000 ( Thermo).
* Tách chiết DNA:
DNA được tách từ tế bào bạch cầu sử dụng bộ Kit Wizard ® Genomic DNA Purification ( Promega Corporation, USA). Các bước tiến hành như sau:
Bước 1: Ly giải tế bào hồng cầu và thu bạch cầu:
- Lấy 300 µl máu toàn phần vào ống eppendorf 1,5ml. - Thêm 900 µl dung dịch Cell Lysis Solution.
- Đảo ống 5-6 lần, sau đó ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm ở 14000 vòng trong 40 giây ở nhiệt độ phòng.
- Loại bỏ tối đa dung dịch nổi, không được chạm vào hạt tủa ở đáy ống, còn lại khoảng 20µl cặn trong ống.
Lặp lại 2 lần các bước trên.
Bước 2: Ly giải màng bạch cầu và màng nhân, thủy phân RNA: - Thêm 300 µl Nucleic Lysis Solution.
- Vortex rồi ủ ở 37 0C trong 30 phút tới khi cặn tan hoàn toàn. Làm mát ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Thêm 1,5 µl dung dịch Rnase solution, đảo đầu ống 5 lần. - Ủ ở 37 0C trong 30 phút.
Bước 3: Loại bỏ protein:
- Thêm 130 µl Protein Precipitation Solution.
- Vortex mạnh rồi ly tâm 14000 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp phân thành lớp: tủa màu nâu ở đáy ống, dung dịch trong suốt chứa DNA ở trên.
Bước 4: Thu DNA và bù nước:
- Thu lớp trên cùng trong suốt chứa DNA sang 1 ống eppendorf khác (không để đầu ống chạm vào kết tủa protein ở đáy ống tránh gây nhiễu chéo DNA với kết tủa).
- Thêm 300 µl Isopropanol. Trộn nhẹ dung dịch bằng đảo đầu cho tới khi xuất hiện sợi kết tủa DNA trắng có thể nhìn thấy. Ly tâm 14000 vòng trong 1 phút có thể thấy hạt DNA kết tủa trắng ở đáy ống.
- Gạn bỏ dung dịch lớp trên, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống. - Thêm 300 µl cồn ethanol 70% ở nhiệt độ phòng. Đảo nhẹ ống vài lần để rửa kết tủa. Ly tâm 14000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Gạn bỏ dung dịch, chú ý không để trôi mất hạt tủa ở đáy ống. - Đặt ống trên giấy thấm và làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm.
- Thêm 100 µl dung dịch DNA Rehydration solution vào ống. Ủ qua đêm ở 40C hoặc ở nhiệt độ phòng. Bảo quản ở - 200C hoặc – 800C.
* Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA:
Lấy 2 µl sản phẩm DNA tách chiết để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang OD bằng máy NanoDrop 1000 (Thermo) bước sóng A260/A280.
- Kết quả OD của mẫu AND được coi là đạt khi nồng độ khoảng 20ng/µl trở lên. Với những mẫu có nồng độ quá cao (> 300 ng/µl ) sẽ được pha loãng để đưa nồng độ < 100ng/µl. Độ tinh sạch DNA được đo bằng tỷ số A260/A280, và mẫu DNA tinh sạch khi tỷ số này từ 1,8-2,0.
- Điện di DNA trên gel Agarose để kiểm tra sự toàn vẹn của DNA.