Đoạn DNA cần được giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Có nhiều phương
pháp giải trình tự khác nhau nhưng thông dụng nhất là phương pháp giải trình tự dựa trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) do F. Sanger và cộng sự phát minh. Hỗn hợp của deoxy và dideoxynucleotide được sử dụng trong phản ứng với nồng độ thích hợp sao cho các dideoxynucleotide sẽ gắn một cách ngẫu nhiên vào mỗi vị trí mà các dideoxynucleotide thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn của các dideoxynucleotide sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau. Nucleotide tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy đồng thời 4 phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa 1 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi DNA hơn kém nhau 1 nucleotide. Trình tự các nucleotide được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại nucleotide. Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ được đối chiếu với trình tự gen trên ngân hàng gen thế giới (GeneBank) và được phân tích để xác định vùng hoặc đột biến điểm.
Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn thiết kế trên nguyên tắc của Sanger. Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong 1 ống nghiệm và chỉ cần điện di trên 1 hàng mà không phải trên 4 hàng như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy phân tích. Dựa vào màu
huỳnh quang mà máy nhận diện được là nuclotide nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích. Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen, đồng thời cũng được sử dụng như một phương pháp đối chứng để kiểm tra độ chính xác, độ đặc hiệu của phương pháp PCR-RFLP.
CHƯƠNG 2