- Nguyên lý: PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng 1 enzym cắt thích hợp. Các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium bromide cho ta biết được tính đa hình thái của đoạn DNA cần phân tích{Rasmussen, 2012 #55}.
- Enzym cắt giới hạn:
Enzym cắt giới hạn hay còn gọi enzym hạn chế, enzym cắt là enzym dưới nhóm quan trọng của các enzym endonuclease, enzym này cắt DNA ở các vị trí xác định dựa trên sự nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với từng enzym thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Enzym cắt giới hạn được dùng để xác định alen liên quan đến các SNPs do sự thay đổi 1 nucleotid trong mỗi SNPs làm thay đổi đoạn trình tự đặc hiệu nhận biết bởi enzym cắt giới hạn trên đoạn DNA đó.
Các enzym giới hạn có đặc điểm sau:
- Đều được chiết tách từ vi khuẩn, và tên của enzym giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn.
- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu ( hay gọi là vị trí giới hạn) cho từng loại enzym.
- Vị trí cắt thường có 4-8 Nu đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3’-5’ và 5’-3’. Vì vậy vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch.
- Sau khi bị cắt, DNA có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các phân tử DNA có các đầu kết dính với các Nu bổ sung cho nhau.
- Điện di DNA:
Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp, DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương của điện
trường. Kỹ thuật phân tích sản phẩm PCR phổ biến và thông dụng nhất hiện nay là điện di trên gel agarose. Tùy theo chiều dài của sản phẩm mà người ta lựa chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao động trong khoảng 0,8-3% agarose và có 1µg/ml ethidium bromide thường 1/10 đến 1/5 tổng thể tích sản phẩm DNA được sử dụng để điện di, phần còn lại được bảo quản ở -40C đến – 200C cho các thí nghiệm tiếp theo. Dung dịch màu có glycerol như bromophenol blue cần phải trộn với sản phẩm PCR để giữ chúng ổn định trong giếng điện di khi tra mẫu vào giếng và theo dõi di chuyển của sản phẩm trong suốt quá trình điện di. Trong quá trình điện di, người ta dùng các mẫu chuẩn là hỗn hợp các đoạn DNA có các chiều dài biết trước nhằm để so sánh kích thước với đoạn DNA cần tìm. Đối với sản phẩm PCR có kích thước rất nhỏ thì kỹ thuật điện di trên polyacrylamid là lựa chọn thích hợp hơn {Văn, 2010 #54}.
Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP: rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc hiện đại. Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình thái đơn nucleotide.
Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn trong việc thiết kế mồi đặc hiệu, và enzym cắt thích hợp để thu được sản phẩm có kích thước khác nhau giúp cho việc nhận định và phân tích kết quả. Quy trình làm thủ công nên mất nhiều thời gian. Hạn chế thấy rõ nhất là khó xác định kiểu gen nếu có nhiều SNPs khác nhau trên đoạn gen bởi nó đòi hỏi nhiều cặp mồi và enzym cắt khác nhau. Hơn nữa, kiểu gen và alen có thể nhận định sai nếu enzym cắt sản phẩm gen khuếch đại không hoàn toàn{Rasmussen, 2012 #55}.