Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là 4 loại nucleotide tự do. Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 940C-950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
-Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 400C- 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30giây đến 1 phút.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extention). Nhiệt độ được tăng lên 720C để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase...) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của 2 đoạn gen mồi{Văn, 2010 #54}.