Từ kết quả của các thí nghiệm trên, lựa chọn đƣợc điều kiện để làm giàu catechin trên cột nhựa macroporous nhƣ sau:
- Nhựa sử dụng: HPD826
- Nồng độ EGCG trong dịch hấp phụ ban đầu: khoảng 500 µg/ml - pH dịch hấp phụ: 4,0
- Dung môi phản hấp phụ: ethanol 30% - Thể tích hấp phụ: 18 BV
- Thể tích dịch phản hấp phụ: 8 BV
Với các điều kiện trên, tiến hành xây dưng phương pháp làm giàu catechin trên cột nhựa HPD826 như sau:
Bước 1: Chuẩn bị cột
EGCG
33
Cột đƣợc sử dụng để nhồi hạt có đƣờng kính 4 cm, chiều dài 1 mét. Đƣa 100 gam nhựa HPD826 đã xử lý lên cột. Thể tích hạt nhồi là BV = 230 ml.
Bước 2: Tiến hành hấp phụ:
- Chuẩn bị dung dịch acid citric có pH khoảng 4.
- Từ cao thô, tiến hành pha 18 BV (4140 ml) dung dịch có nồng độ EGCG xấp xỉ 500 µg/ml từ dung dịch acid citric đã chuẩn bị.
- Đƣa toàn bộ dịch đã pha qua cột nhựa đã chuẩn bị với tốc độ 2 BV/h.
Bước 3: Tiến hành phản hấp phụ:
- Cột nhựa sau giai đoạn hấp phụ đƣợc sửa sạch bằng 5 BV (1150 ml) nƣớc tinh khiết để loại bỏ phần dịch hấp phụ còn sót lại trên hạt.
- Sau đó đƣa 8 BV (1840 ml) ethanol 30% cho chảy qua cột với tốc độ 2 BV/h.
Bước 4: Thu sản phẩm
Toàn bộ dịch phản hấp phụ đƣợc thu lại, cô loại bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 50°C đến khi còn 1/3 thể tích. Sau đó mang dịch đã cô đem đi đông khô ở -50°C, áp suất 0,1 mbar thu lấy sản phẩm.
34
Cao thô chè xanh
Dung dịch EGCG 500µg/ml
Dung dịch acid citric, pH = 4
Cột nhựa macroporous Hấp phụ Rửa cột Ethanol 30% Dịch rửa giải Đông khô Hòa tan 4140 ml 2BV/h 1840 ml 2BV/h Nƣớc tinh khiết Cô quay còn1/3 thể tích 50°C Sản phẩm 1150 ml
Hình 3.7: Quá trình làm giàu catechin chè xanh
-50°C 0,1 mbar
35
Tiến hành làm giàu catechin trên quy mô 100 gam nhựa HPD826, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.8:Kết quả quá trình làm giàu catechin
Kết quả
Khối lƣợng cao thô sử dụng 13,53 g Hàm lƣợng EGCG trong cao thô 15,30% Khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc 3,56 g Hàm lƣợng EGCG trong sản phẩm 40,06 %
Hiệu suất thu hồi EGCG 68,86%
.
36
HÌnh 3.9: Sắc ký đồ cao thô chè xanh
37
Nhận xét: Nhƣ vậy, sau quá trình làm giàu trên cột nhựa macroporous HPD826, hàm lƣợng EGCG trong sản phẩm đã tăng lên 2,6 lần với hiệu suất thu hồi gần 70%. Quan sát hình 3.8 cũng thấy rằng, sản phẩm cao làm giàu có màu sắc sáng hơn so với cao thô chứng tỏ một số tạp màu đã đƣợc loại bỏ sau quá trình hấp phụ và phản hấp phụ trên cột.
So sánh hình ảnh sắc ký đồ trên hình 3.9 và 3.10 của cao thô ban đầu và cao sản phẩm cũng thấy rằng một số các tạp chất cũng đã đƣợc loại bỏ trong quá trình làm giàu. Các peak sắc ký còn lại có thể là của một số catechin khác. Với cùng một lƣợng phân tích, hình ảnh sắc ký đồ cũng cho thấy chiều cao peak của EGCG trong cao làm giàu cao hơn so với cao thô ban đầu. Điều này chứng tỏ hàm lƣợng EGCG trong sản phẩm đã đƣợc tăng lên.
38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận:
Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau:
1. Đánh giá đƣợc một số các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng hấp phụ và phản hấp phụ catechin trên nhựa macroporous nhƣ:
- Nhựa sử dụng: HPD826
- Nồng độ EGCG trong dịch hấp phụ ban đầu: khoảng 500 µg/ml - pH dịch hấp phụ: 4,0
- Dung môi phản hấp phụ: ethanol 30% - Thể tích hấp phụ: 18 BV
- Thể tích dịch phản hấp phụ: 8 BV
2. Từ kết quả đánh giá, lựa chọn và xây dựng quy trình làm giàu catechin nhƣ sau: Dung dịch chè xanh đƣợc pha với nồng độ EGCG khoảng 500 µg/ml từ cao thô ban đầu với dung dịch acid citric có pH ~ 4. Tiến hành hấp phụ trên cột nhựa HPD826 với tốc độ dòng 2 BV/h. Sau quá trình hấp phụ, cột đƣợc rửa kỹ bằng nƣớc tinh khiết sau đó giải hấp phụ bằng ethanol 30%. Dịch thu đƣợc đem cô loại bớt dung môi sau đó đem đông khô ở điều kiện thích hợp thu đƣợc sản phẩm.
Đề xuất:
Trên đây là một số kết quả nghiên cứu bƣớc đầu, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Vì vậy chúng tôi xin đề xuất thêm:
1. Tối ƣu hóa các điều kiện làm giàu và phân lập EGCG trong chè xanh. 2. Đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa macroporous.
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc (2017), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Trƣờng ĐH Dƣợc Hà Nội, trang 112 - 114.
2. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, tập 1, Nhà xuất bản Y học, trang 356. 3. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản
y học, trang 187-188.
Tài liệu Tiếng Anh
4. Amra Perva-Uzunalić et al. (2006), "Extraction of active ingredients from green tea (Camellia sinensis): Extraction efficiency of major catechins and caffeine", Food Chemistry. 96(4), pp 597-605.
5. Ashok Kumar Bo Mattiasson, Igor Yu. Galaev (2010), Macroporous polymer Production Properties and Biotechnological/Biomedical Applications, CRC Press.
6. Chen Zhen‐Yu et al. (2001), "Preparation of flavanol‐rich green tea extract by precipitation with AlCl3", Journal of the Science of Food and Agriculture. 81(10), pp 1034-1038.
7. Copeland EL, Clifford MN Williams Christine M (1998), "Preparation of (–)-epigallocatechin gallate from commercial green tea by caffeine precipitation and solvent partition", Food Chemistry. 61(1-2), pp 81-87. 8. Du XL et al. (2008), "Preparative purification of solanesol from tobacco
leaf extracts by macroporous resins", Chemical engineering & technology. 31(1), pp 87-94.
9. Fu Yujie et al. (2008), "Separation of 7-xylosyl-10-deacetyl paclitaxel and 10-deacetylbaccatin III from the remainder extracts free of paclitaxel using macroporous resins", Journal of Chromatography A. 1177(1), pp 77-86.
10. Fu Yujie et al. (2006), "Optimization of luteolin separation from pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millsp.] leaves by macroporous resins",
Journal of Chromatography A. 1137(2), pp 145-152.
11. Makurazaki Fumio Okada, Japan (1981), "PROCESS FOR PRODUCING CATECHINS", Director of National Research Institute of Tea, Shizuoka, Japan, US.
12. Gao Min, Huang Wei Liu Chun-Zhao (2007), "Separation of scutellarin from crude extracts of Erigeron breviscapus (vant.) Hand. Mazz. by macroporous resins", Journal of Chromatography B. 858(1-2), pp 22-26.
40
13. Harold N Graham et al. (1992), "Green tea composition, consumption, and polyphenol chemistry", Preventive medicine. 21(3), pp 334-350.
14. Jia Guangtao et al. (2008), "Enrichment and purification of madecassoside and asiaticoside from Centella asiatica extracts with macroporous resins", Journal of Chromatography A. 1193(1-2), pp 136- 141.
15. Khan Naghma Mukhtar Hasan et al. (2007), "Tea polyphenols for health promotion", Life sciences. 81(7), pp 519-533.
16. Li Jing et al. (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural product reports. 27(10), pp 1493-1510.
17. Liu Yongfeng et al. (2014), "Simultaneous purification of tea polyphenols and caffeine from discarded green tea by macroporous adsorption resins", European Food Research and Technology. 238(1), pp 59-69. 18. Liu Wei et al.(2010), "Preliminary enrichment and separation of genistein
and apigenin from extracts of pigeon pea roots by macroporous resins",
Bioresource technology. 101(12), pp 4667-4675.
19. Ma Chaoyang et al. (2009), "Preparative purification of salidroside from Rhodiola rosea by two‐step adsorption chromatography on resins",
Journal of separation science. 32(2), pp 185-191.
20. Moore Rosalind J, Jackson Kim G Minihane Anne M (2009), "Green tea (Camellia sinensis) catechins and vascular function", British Journal of Nutrition. 102(12), pp 1790-1802.
21. Okay O et al. (2000), "Macroporous copolymer networks", Progress in polymer science. 25(6), pp 711-779.
22. Obanda Martin Owuor P Okinda (1998), "The changes in black tea quality due to variations of plucking standard and fermentation time",
Food chemistry. 61(4), pp 435-441.
23. Rostagno Mauricio A Prado Juliana M (2013), Natural product extraction: principles and applications, Royal Society of Chemistry, pp 318 - 319.
24. Row Kyung Ho Jin Yinzhe (2006), "Recovery of catechin compounds from Korean tea by solvent extraction", Bioresource technology. 97(5), pp 790-793.
25. Silva EM et al. (2007), "Optimisation of the adsorption of polyphenols from Inga edulis leaves on macroporous resins using an experimental design methodology", Separation and Purification Technology. 53(3), pp 274-280.
41
26. Sing Kenneth SW et al. (1985), "Reporting physisorption data for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (Recommendations 1984)", Pure and applied chemistry. 57(4), pp 603-619.
27. Wagner Hildebert et al. (2011), "Folium Camelliae—Cha- yeh"Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal Medicines, Springer, pp 951-965.
28. Wan JB et al. (2008), "Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins", Separation and Purification Technology. 60(2), pp 198-205.
29. Wang Huafu, Keith Helliwell Xiaoqing You (2000), "Isocratic elution system for the determination of catechins, caffeine and gallic acid in green tea using HPLC", Food Chemistry. 68(1), pp 115-121.
30. Yamamoto Takehiko, Juneja Lekh Raj Kim Mujo (1997), Chemistry and applications of green tea, CRC press.
31. Yang BIN et al. (2009), "Adsorption characteristics of crocin in the extract of gardenia fruits (Gardenia jasminoides Ellis) on macroporous resins", Journal of food process engineering. 32(1), pp 35-52.
32. Zhang Bin et al. (2008), "Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resins", Journal of Chromatography B. 867(2), pp 253-258.
33. Zhang Xin et al. (2013), "Simultaneous separation and purification of tea bioactives from summer green tea by column chromatography", J. Chem. Soc. Pak. 35(5), pp 1258.
34. Zhu Qin Yan et al. (1997), "Stability of green tea catechins", Journal of Agricultural and Food Chemistry. 45(12), pp 4624-4628.