Quá trình chiết xuất đƣợc thực hiện trong bình chiết có bộ phận gia nhiệt. Tham khảo tài liệu [4] và thực nghiệm, quy trình chiết xuất đƣợc tiến hành nhƣ sau: Nạp 1kg bột dƣợc liệu vào bình chiết. Bổ sung thêm 2 lít dung dịch ethanol 40%, gia nhiệt đến 70°C và duy trì trong 1 giờ. Sau thời gian quy định, rút dịch chiết. Phần bã tiếp tục thêm 2 lít dung môi, chiết lặp lại 2 lần theo quy trình trên.
18
Các phần dịch chiết đƣợc tập trung lại, cô loại bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 60°C đến khi còn 1/3 thể tích. Sau đó, dịch thu đƣợc mang đi phun sấy tạo cao thô ở các điều kiện: nhiệt độ đầu vào 140°C, nhiệt độ đầu ra 67 - 70 °C, tốc độ bơm 30 – 35%, áp suất phun dịch 100%, áp suất khí nóng 400- 600 mbar, áp suất khí âm -40 mbar.
2.3.4 Phương pháp nghiên cứu sự hấp phụ và phản hấp phụ tĩnh
2.3.4.1 Lựa chọn nhựa macroporous
Tiến hành đánh giá khả năng hấp phụ và phản hấp phụ EGCG đối với các nhựa macroporous, từ đó lựa chọn nhựa thích hợp cho việc làm giàu catechin.
Chuẩn bị hạt nhựa: Chuẩn bị 2 bình nón, cân vào mỗi bình một lƣợng nhựa đã đƣợc hoạt hóa của D101 và HPD826 (tƣơng ứng với 1 gam nhựa khô).
Chuẩn bị dịch ban đầu: Cân khoảng 1,3 gam cao thô ban đầu pha vào 500 ml nƣớc. Lọc dịch qua phễu lọc Bunchner để loại bỏ cắn.
Tiến hành hấp phụ: Đƣa vào mỗi bình nón chứa nhựa 200 ml dịch ban đầu. Sau đó, lắc bằng máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ.
Sau quá trình hấp phụ, lọc lấy nhựa ở mỗi bình nón, rửa kỹ bằng nƣớc cất. Tiếp theo tiến hành phản ứng phản hấp phụ. Nhựa vừa đƣợc hấp phụ đƣa lại vào mỗi bình nón, thêm 200 ml dung dịch ethanol 70%, sau đó đem lắc bằng máy với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ.
Các mẫu dịch sau khi hấp phụ, dịch sau phản hấp phụ đem đi định lƣợng bằng HPLC theo phƣơng pháp ở mục 2.3.1.
Tính toán
Dung lƣợng hấp phụ:
Tỷ số phản hấp phụ:
19
Qe: là dung lƣợng hấp phụ (mg/g); C0 và Ce lần lƣợt là nồng độ EGCG trong dịch trƣớc và sau hấp phụ (µg/ml); W là khối lƣợng nhựa khô (g); Vi và Vd
lần lƣợt là thể tích dịch ban đầu và phản hấp phụ (ml); Cd là nồng độ EGCG trong dịch phản hấp phụ (µg/ml); D là tỷ số phản hấp phụ (%).
2.3.4.2 Khảo sát nồng độ dịch ban đầu
Tiến hành thí nghiệm nhƣ sau:
Chuẩn bị 3 bình nón 250 ml, cân chính xác một lƣợng nhựa HPD826 đã xử lý ( tƣơng ứng với 1 gam nhựa khô) cho vào mỗi bình.
Từ cao thô ban đầu, pha thành các dịch lần lƣợt có nồng độ EGCG khoảng 350µg/ml; 500µg/ml; 650µg/ml.
Thêm vào mỗi bình nón chứa nhựa HPD826 vừa chuẩn bị 200 ml dịch có nồng độ EGCG lần lƣợt xấp xỉ là 350 µg/ml; 500 µg/ml; 650 µg/ml. Sau đó đem lắc ở tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ. Mẫu dịch sau hấp phụ đem đi định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ở mục 2.3.1. Tính toán Hiệu suất hấp phụ: Trong đó: C0: Nồng độ dịch ban đầu Ce: Nồng độ dịch sau hấp phụ H (%): Hiệu suất hấp phụ
2.3.4.3 Khảo sát pH dịch ban đầu
Chuẩn bị 3 bình nón, cân chính xác một lƣợng nhựa đã xử lý (tƣơng đƣơng 1 gam nhựa khô) cho lần lƣợt vào các bình.
Pha các dung dịch nƣớc acid ctric có pH lần lƣợt là 2,3,4.
Pha lần lƣợt các dịch có nồng độ EGCG xấp xỉ 500 µg/ml từ cao thô với các dung dịch acid citric trên.
20
Thêm lần lƣợt 200 ml các dịch trên vào các bình nón chứa nhựa đã chuẩn bị. Sau đó, đem lắc bằng máy với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ. EGCG trong mẫu dịch sau hấp phụ sẽ đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC ở mục 2.3.1.
2.3.4.4 Khảo sát nồng độ dung môi rửa giải
Tiến hành nhƣ sau: 10 gam nhựa sau khi xử lý đƣợc hấp phụ với 600 ml dung dịch có nồng độ EGCG ban đầu xấp xỉ 500 µg/ml trong bình nón. Bình nón đƣợc đậy nắp kín mang lắc ở tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ. Sau đó, lọc lấy hạt nhựa, rửa kỹ bằng nƣớc tinh khiết.
Chuẩn bị 6 bình nón, cân chính xác vào mỗi bình nón khoảng 1 gam nhựa HPD826 vừa hấp phụ ở trên. Thêm vào mỗi bình nón 50 ml ethanol có nồng độ lần lƣợt là 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 96%. Đậy lắp kín, mang các bình nón lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 giờ. Dịch sau phản hấp phụ đƣợc đem đi định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC.
Hút 5ml dịch từ mỗi bình nón đem cô cạn. Cân khối lƣợng cắn thu đƣợc.
Tính toán:
Hàm lƣợng EGCG trong cắn là:
Trong đó: C: nồng độ EGCG m: khối lƣợng cắn
X: hàm lƣợng EGCG (%).
2.3.5 Phương pháp nghiên cứu sự hấp phụ và phản hấp phụ động
Đánh giá sự hấp phụ và phản hấp phụ động đƣợc thực hiện trên cột thủy tinh dài 50 cm, đƣờng kính 1 cm. Cột thủy tinh đƣợc nhồi 6,5 gam nhựa đã xử lý (tƣơng đƣơng khoảng 2 gam nhựa khô). Thể tích hạt nhựa đƣợc nhồi là BV=10 ml.
21
2.3.5.1 Khảo sát thể tích dịch nạp
Chuẩn bị dịch nạp cột: Cao thô đƣợc pha thành dung dịch có nồng độ EGCG khoảng 500 µg/ml.
Tiến hành hấp phụ: Dịch vừa pha đƣợc đƣa cẩn thận lên cột với tốc độ 2BV/h. Theo dõi lƣợng EGCG của dịch ra khỏi cột sau mỗi BV bằng SKLM: chấm cùng một thể tích dịch ban đầu và dịch chảy ra từ cột lên bản mỏng. Theo dõi quá trình xuất hiện vết EGCG trên bản mỏng.
Lấy mẫu sau mỗi 3 BV. Định lƣợng các mẫu bằng phƣơng pháp HPLC.
2.3.5.2 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải
Sau quá trình hấp phụ dịch lên cột nhựa xảy ra hoàn toàn ở mục 2.3.5.1, tiến hành quá trình giải hấp phụ nhƣ sau:
Rửa nhựa kỹ trên cột để loại bỏ các tạp và dịch ban đầu dƣ còn sót bằng 5 BV nƣớc tinh khiết.
Sau đó, đƣa dung dịch ethanol 30% chảy qua cột với tốc độ 2 BV/h. Lấy mẫu sau mỗi 2 BV. Định lƣợng mẫu bằng phƣơng pháp HPLC.
Theo dõi lƣợng EGCG xuất hiện trong dịch rửa giải sau mỗi BV bằng SKLM: Đƣa một thể tích dịch giống nhau của các mẫu lên bản mỏng. Theo dõi quá trình xuất hiện vết EGCG trên bản mỏng. Quá trình rửa giải kết thúc khi vết EGCG trên bản mỏng không còn xuất hiện.
22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng
Phƣơng pháp định lƣợng EGCG bằng HPLC đƣợc thẩm định dựa trên các tiêu chí sau:
- Độ thích hợp hệ thống - Khoảng tuyến tính
3.1.1 Độ thích hợp hệ thống
Kết quả đƣợc đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích peak và thời gian lƣu. Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn EGCG có nồng độ khoảng 100µg/ml . Ghi lại các giá trị về thời gian lƣu và diện tích peak.
Bảng 3.1: Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 RSD (%) Thời gian lƣu (phút) 20,537 20,856 21,357 21,145 20,965 21,001 0,59 Diện tích peak (mAU) 4018581 4090915 4094934 3970358 3989647 4131101 1,61
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của diện tích peak và thời gian lƣu của EGCG nhỏ hơn 2% cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp.
3.1.2 Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn EGCG có nồng độ trong khoảng từ 8 đến 300 µg/ml. Tiến hành chạy HPLC các mẫu theo điều kiện đã khảo sát thu đƣợc kết quả ở bảng sau:
23
Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ EGCG và diện tích peak
Nồng độ EGCG (µg/ml) 8,15 40,74 81,48 162,96 203,70 285,18 Diện tích peak (mAU) 623091 2040551 4018581 7060204 9374182 13218274
Phương trình hồi quy có dạng:
y=44979x +191930 với R2 =0,9975
Hình 3.1: Đường biểu diễn tương quan giữa diện tích peak vào nồng độ EGCG
Nhận xét: Đƣờng chuẩn đƣợc đánh giá thông qua hệ số tƣơng quan R2. Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo thực hiện phép phân tích định lƣợng EGCG.
3.2 Khảo sát sự hấp phụ và phản hấp phụ tĩnh trên các nhựa macroporous
3.2.1 Lựa chọn nhựa macroporous
Để đánh giá khả năng hấp phụ của catechin trên 2 nhựa D101 và HPD826, tiến hành thí nghiệm nhƣ ở mục 2.3.4.1. y = 44979x + 19193 R² = 0.997 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 0 50 100 150 200 250 300 Diện tích peak (m AU ) Nồng độ (µg/ml)
24
Kết quả so sánh dung lƣợng và phần trăm phản hấp phụ EGCG đối với 2 hạt nhựa D101 và HPD- 826 đƣợc trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.2:
Bảng 3.3: Kết quả sự hấp phụ và phản hấp phụ của EGCG
Hạt nhựa macropopus Dung lƣợng hấp phụ Qe (mg/g) Tỷ số phản hấp phụ (%) D101 36,60 76,01 HPD826 61,53 82,10
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy các đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ của EGCG lên 2 nhựa D101 và HPD826. Dung lƣợng hấp phụ của nhựa HPD826 cao hơn nhựa D101 tới 1,7 lần đồng thời khả năng phản hấp phụ cũng cao hơn 6%. Điều này cho thấy khả năng hấp phụ và phản hấp phụ EGCG lên nhựa HPD826 tốt hơn so với D101.
Theo tài liệu [10] các đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ của nhựa macroporous không chỉ phụ thuộc vào cấu trúc hóa học và độ phân cực mà còn phụ thuộc vào diện tích bề mặt và đƣờng kính lỗ xốp. Do EGCG có chứa các vòng benzen không phân cực, 8 nhóm hydroxyl và 1 nhóm carboxyl nên các nhựa có cấu trúc từ phân cực đến không phân cực hoặc liên kết hydro đều có khả năng hấp phụ. Vì vậy D101 và HPD826 là 2 nhựa đƣợc lựa chọn để khảo sát trong nghiên cứu này. Do nhựa HPD826 có diện tích bề mặt lớn hơn (500-600 m2/g) so với nhựa D101 (400 m2/g) nên lực VanderWaals có khả năng giúp EGCG đƣợc hấp phụ nhiều hơn trên bề mặt nhựa HPD826. Bên cạnh đó, do chứa nhiều nhóm phenolic trong cấu trúc nên EGCG có thể hình thành nên các liên kết hydro với nhựa HPD826. Tất cả những điều này có thể làm cho nhựa HPD826 có khả năng hấp phụ EGCG tốt hơn. Vì vậy, nhựa HPD826 đƣợc lựa chọn để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Khảo sát nồng độ dịch ban đầu
25
Kết quả dung lƣợng hấp phụ và hiệu suất hấp phụ EGCG trong dịch chè xanh lên hạt nhựa HPD826 đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4: Dung lượng và hiệu suất hấp phụ ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ ban đầu C0 (µg/ml) Dung lƣợng hấp phụ (mg/g) Hiệu suất hấp phụ (%) 350 36,34 51,91 500 75,65 75,65 650 72,24 55,57
Hình 3.2: Biểu diễn hiệu suất hấp phụ theo nồng độ EGCG
Bảng 3.4 và hình 3.2 cho thấy khi tăng nồng độ dịch ba đầu, dung lƣợng hấp phụ EGCG cũng tăng lên và đạt cực đại (từ 36,34 đến 75,65 mg/g nhựa khô), sau đó bắt đầu có xu hƣớng giảm dần xuống còn 72,24 mg/g. Bên cạnh đó, hiệu suất hấp phụ cũng đạt cực đại (75,65%) tại nồng độ 500 µg/ml. Kết quả trên có thể đƣợc giải thích là do mỗi nhựa sẽ có một dung lƣợng hấp phụ cực đại. Khi lƣợng hoạt chất trong dịch ban đầu tăng lên, khả năng hấp phụ của nhựa cũng tăng lên đến giá trị cực đại, sau đó không tăng nữa đồng thời hiệu suất hấp
51.91% 75.65% 55.57% 40 50 60 70 80 350 500 650 Hiệu suất hấp phụ % Nồng độ EGCG (µg/ml)
26
phụ sẽ bắt đầu bị giảm đi do lƣợng hoạt chất không đƣợc hấp phụ bắt đầu tăng lên.
Nhƣ vậy để tránh lãng phí lƣợng hoạt chất không đƣợc hấp phụ, dịch chiết với nồng độ EGCG ban đầu khoảng 500 µg/ml đƣợc lựa chọn để làm giàu catechin.
3.2.3 Khảo sát pH dịch ban đầu
Tiến hành thí nghiệm trên nhựa HPD826 nhƣ ở mục 2.3.4.3, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.5: Dung lượng hấp phụ tại các pH khác nhau
pH Dung lƣợng hấp phụ (mg/g)
2 74,02
3 72,98
4 71,24
Nhận xét: Acid citric vốn là một chất chống oxy hóa vốn đƣợc sử dụng nhiều trong thực phẩm. EGCG và các catechin cũng là các chất có tính khử mạnh, dễ bị oxy hóa và không bền trong dung dịch nƣớc. Vì vậy ở đây, acid citric đƣợc sử dụng để ổn định các catechin trong dịch chiết chè xanh.
Khi pH dịch hấp phụ tăng dần từ 2 đến 4 thì dung lƣợng hấp phụ lên nhựa HPD826 giảm dần nhƣng không đáng kể (từ 74,03 xuống 71,24 mg/g nhựa khô). Sự giảm này có thể đƣợc giải thích do khi ở pH cao, các nhóm OH - phenol phân ly tạo thành nhiều anion hơn. Khi đó, sự hình thành các liên kết hydro giữa chất hấp phụ và nhựa HPD826 giảm đi, khả năng hấp phụ hoạt chất lên nhựa cũng giảm đi. Tuy nhiên, EGCG là một ester, dễ bị thủy phân tại pH thấp nên tại pH = 2, EGCG kém bền vững nhất trong dung dịch. Trong quy mô sản xuất lớn, dịch chiết chè xanh có thể phải lƣu giữ trong thời gian dài. Mà các catechin bền vững nhất tại pH xấp xỉ 4, vì vậy, cân nhắc đánh giá các yếu tố và
27
để đảm bảo giảm sự mất mát hoạt chất do bị oxy hóa trong dịch chè xanh, pH dịch hấp phụ đƣợc lựa chọn là 4.
3.2.4 Khảo sát nồng độ dung môi rửa giải
Để lựa chọn nồng độ dung môi tối ƣu cho quá trình rửa giải, tiến hành thí nghiệm nhƣ ở mục 2.3.4.4 , thu đƣợc kết quả nhƣ ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả sự phản hấp phụ EGCG phụ tại các nồng độ ethanol
Nồng độ ethanol (%) Nồng độ EGCG (µg/ml) Khối lƣợng cắn thu đƣợc (mg) Hàm lƣợng EGCG (%) 15 149,76 13,25 5,65 30 212,21 14,50 7,31 45 185,01 15,75 5,87 60 169,12 15,00 5,63 75 167,66 13,25 6,32 96 153,09 21,25 3,60
Nhận xét: Dựa vào kết quả ở bảng 3.6 thấy rằng nồng độ EGCG trong dịch phản hấp phụ cao nhất (212,21 µg/ml) khi nồng độ ethanol rửa giải là 30%. Khi bắt đầu tăng nồng độ dung dịch ethanol từ 15% lên 30%, nồng độ EGCG thu đƣợc cũng tăng dần lên đến 212,21 µg/ml sau đó giảm dần ở những nồng độ tiếp theo. Nhƣ vậy, khả năng phản hấp phụ của EGCG cũng nhƣ catechin đạt đỉnh khi nồng độ ethanol rửa giải là 30%. Kết quả trên có thể giải thích rằng, ở nồng độ ethanol loãng, các liên kết hydro giữa EGCG cũng nhƣ các catechin khác với bề mặt hạt nhựa chƣa bị phá vỡ hoàn toàn nên nồng độ hoạt chất trong dịch phản hấp phụ còn thấp (149,76 µg/ml). Tuy nhiên khi tăng dần nồng độ ethanol từ 30% đến 96%, nồng độ EGCG thu đƣợc lại giảm dần. Điều này có thể là do, ở nồng độ ethanol càng cao, khả năng hòa tan các tạp chất dễ tan trong cồn nhƣ cafein, polysarcharide càng lớn. Do vậy, khả năng phản hấp phụ của
28
các catechin vào dung dịch ethanol cũng có thể bị ảnh hƣởng và giảm đi đáng kể.
Tuy nhiên khi theo dõi lƣợng cắn thì thấy rằng, hàm lƣợng EGCG trong cắn thu đƣợc ở các nồng độ ethanol khác nhau thì không có sự khác biệt đáng kể. Vì vậy, để hiệu suất thu hồi các catechin là cao nhất chọn nồng độ ethanol rửa giải là 30%.
3.3 Khảo sát quá trình hấp phụ và giải hấp phụ động trên cột nhựa
Sau quá trình khảo sát sự hấp phụ và phản hấp phụ tĩnh lên các nhựa macroporous, các thông số đƣợc lựa chọn để tối ƣu hóa cho quá trình làm giàu catechin trên cột là:
- Nhựa macroporous đƣợc chọn: HPD826 - Nồng độ dịch hấp phụ khoảng 500 µg/ml - pH dịch hấp phụ bằng 4
- Nồng độ dung môi phản hấp phụ là ethanol 30%
Các thông số trên sẽ đƣợc sử dụng để tiếp tục khảo sát các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ khi thực hiện trên cột nhựa.
3.3.1 Thể tích dịch hấp phụ
Để khảo sát quá trình hấp phụ trên cột nhựa, tiến hành thí nghiệm nhƣ ở mục 2.3.5.1 với các thông số đã lựa chọn.