phiên mã gen survivin sau 24 giờ trên hai dòng tế bào
Survivin, trong những năm gần đây được xem như một maker ung thư vì sự biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư và có giá trị tiên lượng [21,45]. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự tăng biểu hiện mạnh mẽ của survivin liên qua đế việc hình thành khối u và làm tăng ác tính của tế bào ung thư phổi [36]. Nghiên cứu khác cho thấy một lượng lớn protein survivin ảnh hưởng tới tăng sinh tế bào, giảm mức độ apoptosis, tăng sức đề kháng hóa trị liệu, tăng tái phát khối u, rút ngắn thời gian sống của bệnh nhân [36]. Với vai trò là gen ung thư nằm ở vị trí giao thoa của nhiều mạng lưới tín hiệu khác nhau của tế bào, các liệu pháp điều trị ung thư hướng đích survivin đã được đề xuất nhằm mục đích ức chế khả năng phát triển của khối u và tăng cường đáp ứng của tế bào ung thư với các thuốc chống ung thư, các phương pháp này cũng được đánh giá khả quan hơn các liệu pháp điều trị ung thư khác.
Với kết quả tách chiết và đo quang phổ, chúng tôi khẳng định được mẫu ARN tổng số thu được là tinh sạch để tiếp tục tiến hành thử nghiệm. Trong khuôn khổ nghiên cứu chỉ đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên mức độ phiên mã gen surviving, nên chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật Realtime RT- PCR để đánh giá mức độ phiên mã gen survivin. Kỹ thuật này được sử dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá biểu hiện gen do độ đặc hiệu cao và độ chính xác cao hơn phản ứng PCR thông thường, tránh nhiễm sản phẩm do sản phẩm được định lượng trực tiếp trên máy sau mỗi chu kỳ nhiệt. Nghiên cứu sử dụng probe làm chất màu phát huỳnh quang để tăng hiệu quả phản ứng nhờ tính đặc hiệu của probe cao hơn so với chất màu SYBR Green.
Trong các phương pháp đánh giá biểu hiện gen, ngoài việc đánh giá biểu hiện của gen đích người ta có thể đánh giá bằng cách so sánh sự biểu hiện của gen này với
một gen tham chiếu – là gen có biểu hiện như như nhau giữa các mẫu tế bào, cách này có độ chính xác cao hơn nhưng tốn kém do phải tiến hành nhiều mẫu cùng lúc. Do vậy, trong khuôn khổ nghiên cứu, chúng tôi chỉ đánh giá mức độ phiên mã gen survivin bằng cách so sánh lượng mARN survivin ban đầu có trong các mẫu giữa nhóm chứng và nhóm thử.
Tiếp nối các nghiên cứu trước của TS. Nguyễn Minh Hiền về mức độ biểu hiện gen mARN survivin trên dòng tế bào ung thư vú BT474, nghiên cứu của LeeHaf Phương đã chỉ ra ảnh hưởng của Glycyl funtumin nồng độ 6,0 μg/ml ức chế 40% sự phiên mã gen survivin trên dòng tế bào [5], chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của GF lên mức độ phiên mã gen survivin tại các nồng độ khác nhau trong 24 giờ trên cả hai dòng tế bào BT4747 và A549. Kết quả cho thấy tại nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml Glycyl funtumin làm giảm lượng mARN survivin ở nhóm thử so với nhóm chứng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Còn với nồng độ 6,0 μg/ml, GF làm giảm mức độ phiên mã gen survivin (p < 0,05) trên cả hai dòng tế bào. Cụ thể với nồng độ 6,0 μg/ml gen survivin giảm biểu hiện ở mức độ phiên mã 7,46 ± 3,23 lần ở dòng tế bào BT474 và 63,60 ± 15,65 ở dòng tế bào A549 sau 24 giờ thử thuốc. Như vậy, nghiên cứu này bước đầu xác lập các mức liều cụ thể có tác dụng đối với sự phiên mã gen survivin trên hai dòng tế bào ung thư vú BT474 và ung thư phổi A549, tạo tiền đề cho các nghiên cứu in vitro và in vivo tiếp theo.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiều hợp chất khác ngoài GF cũng có tác dụng anti-survivin [21, 37]. Ngoài dấu ấn ung thư survivin, các nhà nghiên cứu còn sàng lọc và thử nghiệm các chất ức chế các dấu ấn ung thư khác như các protein họ Bcl-2, tương tác Survivin và Borealin [32]…Có thể thấy việc nghiên cứu các chất có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư đang rất được quan tâm. Trong giới hạn nghiên cứu này chỉ dừng lại ở xét sự ảnh hưởng của một hợp chất cụ thể là Glycyl funtumin trên đích là gen survivin, tại 3 mức nồng độ khởi điểm trong 24 giờ. Vì vậy, kết quả của nghiên cứu này, sẽ giúp xác định mức liều cụ thể và hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo ở mức độ sâu hơn. Tuy nhiên, cần khắc phục những điểm còn hạn chế về mặt kỹ thuật, điều kiện thí nghiệm cũng như chất lượng phản ứng realtime PCR, tiến hành đồng thời nhiều mẫu hơn, ở nhiều mức nồng độ và thời gian cùng lúc sẽ có được những kết quả khả quan hơn.
KẾT LUẬN
Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi rút ra được kết luận sau:
- Tại nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml nồng độ mARN survivin có trong các mẫu sau phơi nhiễm GF (AS 1,5 - BT474) = 199,06 ± 108,07, (AS 3,0 - BT474) = 329,54 ± 144,49, (ĐC BT474) = 394,69 ± 88,83; (AS 1,5 - A549) = 62,43 ± 49,81, (AS 3,0 - A549) = 27,26 ± 13,59, (ĐC A549) = 65,21 ± 32,77 với p<0,05, vậy glycyl funtumin không ảnh hưởng tới mức độ phiên mã gen survivin sau 24 giờ thử thuốc.
- Tại nồng độ 6,0 μg/ml, GF ức chế sự phiên mã gen survivin với p < 0,05 trên cả hai dòng tế bào sau 24 giờ thử thuốc. Nồng độ mARN survivin có trong các mẫu sau phơi nhiễm GF (AS 6 - BT474) = 235,57 ± 126,10, (ĐC BT474) = 6909,24± 2414,34; (AS 6 - A549) = 20,17 ± 3,97, (ĐC A549) = 1038,74 ± 400,91. Mức độ phiên mã gen survivin giảm 7,46 ± 3,23 lần so với nhóm chứng trên dòng tế bào BT474 và giảm 63,60 ± 15,65 lần trên dòng tế bào A549.
KIẾN NGHỊ
1.Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của Glycyl funtumin nồng độ khác nhau trong các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau lên sự biểu hiện của một số gen ung thư khác. 2.Ứng dụng mô hình nghiên cứu và kỹ thuật realtime RT-PCR để đánh giá tác dụng của các thuốc khác.
3.Tiếp tục sử dụng phương pháp này để thử nghiệm tác dụng thuốc trên mô hình in vivo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Đào Kim Chi (2005), Hoàn thiện quy trình sản xuất thuốc tiêm Aslem điều
hóa miễn dịch, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật của sự án KC10-DA13.
[2] Đào Kim Chi (2006), Tổng kết đề tài thuốc kích thích miễn dịch Aslem, Tạp chí Dược học, số 367, 11A - 2016, tr. 124-127.
[3] Đào Thi Kim Chi (1984), Tổng hợp Funtumin, một số peptidyl funtumin và thăm dò tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu của chúng, Luận án Phó Tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
[4] Đỗ Hồng Quảng (2001), Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học
của Methyonul Glycyl funtumin, Tr. 10 -12, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Hà
Nội.
[5] Lê Hà Phương (2016), Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen survivin trên một số
dòng tế bào ung thư, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Hà Nội.
[6] Lê Thị Thu Huyền (2011), Bước đầu nghiên cứu Dược Động Học của Glycyl
funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC-MS/MS, Tr. 3-4, Luận văn Thạc
Sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
[7] Nguyễn Minh Hiền (2014), Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA,
survivin mRNA từ tế bào ung thư vú, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học
Y Hà Nội, Hà Nội
Tiếng Anh
[8] Altieri D.C. (2003), "Validating survivin as a cancer therapeutic target",
Nature Reviews Cancer.3(1), pp. 46-54.
[9] Ambrosini G, Altieri DC (1997). “A novel anti-apoptosis gene, Survivin, expressed in cancer and lymphoma”. Nature Medicine. 3(8), pp. 917-921 [10] Badran A. et al. (2004), "Identification of a novel splice variant of the human
anti-apoptosis gene survivin", Biochemical and biophysical research
communications. 314(3), pp. 902-907.
[11] Berthelet J. et al. (2013), "Regulation of apoptosis by inhibitors of apoptosis( IAPs)", Cells. 2(1), pp. 163-187.
[12] Bisen P. S. et al. (2013), "Key apoptoic regulators", Biology of oral cancer, CRC Press.
[13] Blanc-Brude O. P. et al. (2003), "Therapeutic Targeting of the Survivin Pathway in Cancer Initiation of Mitochondrial Apoptosis and Suppression of Tumor-associated Angiogenesis", Clinical Cancer Research. 9(7), pp. 2683- 2692.
[14] Brentnall M. et al. (2013), " Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis", BMC cell biology.14(1), pp. 32
[15] Caldas H. et al. (2005), "Survivin 2α: a novel survivin splice variant expressed in human malignancies", Molecular cancer. 4(1), pp. 11.
[16] Carter B. Z. et al. (2012), " Survivin is highly expressed in CD34+ 38- leukemic stem/progenitor cells and predicts poor clinical outcomes in AML",
Blood. 120(1), pp. 173-180.
[17] Chandele A. et al. (2004), "Upregulation of survivin in G2/M cells and inhibition of caspase 9 activity enhances resistance in staurosporine-induced apoptosis", Neoplasia. 6(1), pp. 29-40.
[18] Chen X. et al. (2016), "Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies", Journal of Cancer. 7(3), pp. 314-323.
[19] Deveraux Q. L. et al. (1999), " IAP family proteins-suppressors of apoptosis",
Genes & development. 13(3), pp. 239-252.
[20] Dvorask Z. et al. (2003), "Approaches to messenger RNA detection- comparison of methods", Biomed Pap. 147, pp. 131-135
[21] Eltham S. Abdol - Khalegh B. et al. (2015), "Piperine derivatives as potential inhibitors of Survivin: An in silico molecular docking", Computer in Biology
and Medicine, 63, pp. 219-227.
[22] Falleni M., Pellegrini C., Marchetti A., Oprandi B., Buttitta F., Barassi F., Santambrogio L., Coggi G., Bosari S.(2003), “Survivin gene expression in early-stage non-small cell lung cancer”, The J. of Pathology, 200(5), pp.620- 626.
[23] Garcias-Nogales P. et al. (2010), "Comparison of commercially-available RNA extraction methods for effective bacterial RNA isolation from milk spiked samples", Electronic Journal of Biotachnology. 13(5), pp. 19-20.
[24] Giesen E. M. et al. (1981), " The effect of LH1, an aminoacyl - steroid, on cultured hepatoma cells", Cancer Biochem, Byophys. 5, pp. 233-238.
[25] Guil S. et al. (2005), " RNA - RNA interactions in gene regulation: the coding and noncoding players", Trends in biochemical sciences.40(5), pp. 248-256. [26] Helen Doolittle, Armand Morel and Denis Talbot(2010), “Survivin -
directed anticancer therapies - A review ò pre-clinical dât and early-phase clinical trials”, European Oncology, 6(1), pp. 10-14.
[27] https://www.vinphaco.com.vn/product/b
[28] Ku J. H. et al. (2012), " Urine survivin as a diagnostic biomarker for bladder cancer: a systematic review", BJU international.110(5), pp. 630-636.
[29] Kusner L. L. et al. (2014), "Survivin as a potential mediator to support autoreactive cell survival in myasthenia gravis: a human and animal model study", Plos one. 9(7), pp. e102231
[30] Kyani k. et al. (2014), "Detection of survivin 2α gene expression in thyroid nodules", Journal of cancer research and the rapeutics. 10(2), pp. 312.
[31] LiF (2003), “Survivin stufy: what is the next wave?” J Cell Physiol, 197(1), 8- 29.
[32]
Liyun Yu et al.,"High-throughput screening for Survivin and Borealin interaction inhibitors in hepatocellular carcinoma", Biochemical and
Biophysical Research Communication,484(3), pp. 642-647
[33] Mahotka C. et al. (1999), "Survivin -ΔEx3 and survivin - 2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor survivin with different antiapoptoic properties", Cancer Research. 59(24), pp. 6097-6102.
[34] Mirza A. et al. (2002), " Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependennt apoptoic pathway",Oncogene. 21(17), pp. 2613-2622.
[35] Muzio L. L. et al. (2001), " Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma", Experimental and molecular pathology.70(3), pp. 249-254.
[36] Pennati M.et al.(2007), " Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions", Carcinogenesis. 28(6), pp. 1133-1139.
[37]
Qinghui W. et al. (2018), "Synthesis and biological evaluation of indole-based UC-112 analogs as potent and selective survivin inhibitors", European
Journal of Medicinal Chemistry ,149, pp. 211-224
[38] Romanowski T. et al. (2006), "Housekeeping genes as a reference in quantitive realtime RT-PCR", Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej (online). 61, pp. 500-510.
[39] Sanhueza C. et al. (2015), " The twisted surrvivin connection to angiogenesis",
Molecular cancer. 14(1), pp. 1
[40] Tirrof E. et al. (2006), "Altered expression off c-IAP1, surrvivin and Smac contributes to chemotherapy resistance in thyroid cancer cells", Camcer
[41] Velculescu V. et al., "Analysis of human transcriptomes", Nature Genetic. 23, pp. 117818.
[42] Waligorska-Stachura J. et al. (2014), " Survivin -ΔEx3 overexpression in thyroid malignancies", Plos One. 9(6).
[43] Wang QP et al (2013). Survivin up-regulates the expression of breast cancer resistance protein(BCRP) through attenuating the suppression of p53 on NF- kappaB expression in MCF-7/5-FU cells. Int J Biochem Cell Biol, 45(49), 2036-44.
[44] Wang Y., Jiang L. L., Wu J. F., Liu Z.(2016), “Protective effect of honokiol against endometriosis in rats via attenuating survivin and Bcl-2: A mechanistic stydy”, Cell Mol. Biol., 62(1), pp. 1-5.
[45] Wang Y.-F. et al. (2014), " Inhibition of Surrvivin Reduces HIF-1α, TGF-β1 and TFE3 in Salivary Adenoid Cystic Carcinoma", Plos one. 9(12), pp. 114051
[46] Wang Z. et al. (2004), "Survivin regulates the p53 tumor suppressor gene family", Oncogene. 23(49), pp. 8146-8153.
[47] Wright M. E. et al. (2000), "Caspase-3 and inhibitor of apoptosis protein(s) interations in Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells", FEBS letters.481(1), pp. 13-18.
[48] Yang M. et al, (2013), "Analysis of the expression levels of survivin and VEGF in patients with acute lymphoblastic leukemia", Experimental and therapeutic medicine. 5(1), pp. 305-307.
[49] Yu X. et al. (2016), "The interplay between human herpes simplex virus infection and the apoptosis and necroptosis cell death pathways", Virology Journal. 13(1), pp. 1.
[50]
Zhiyin Song et al. (2003), Direct Interaction between Survivin and Smac/DIABLO Is Essential for the Anti-apoptotic Activity of Survivin during Taxol-induced Apoptosis”, Journal of Biology Chemistry
[51] Zhu J. et al (2016), "Targeting survivin using a combinaton of miR-494 and survivin shRNA has synergistic effects in the suspension of prostate cancer growth", Molecular Medicine Reports. 13(2), pp. 1602-1610.