Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu của đề tài, quá trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ sau:
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy tế bào
- Môi trường nuôi cấy tế bào:
- Môi trường bổ sung đầy đủ (BSĐĐ): DMEM high glucose (invitrogen) + 10% FBS (Invitrogen) + 1% P/S (Invitrogen) + 2 mM L-Glutamin.
- Môi trường giữ chủng tế bào: Môi trường BSĐĐ + 10% DMSO. Nuôi cấy tế bào trên đĩa nghiên cứu:
- Xác định thể tích dịch tế bào ứng với số lượng tế bào là 104 tế bào. Bổ sung thêm 10 ml môi trường bổ sung đầy đủ và đưa vào đĩa nuôi cấy có đường kính 3,5 cm. Tế bào được nuôi theo dạng bám đáy ở 37oC, 5% CO2 trong 3 ngày.
Tiến hành thử thuốc:
Sau 24 giờ, thu tế bào và tách ARN bằng Trizol
Real-time RT-PCR định lượng biểu hiện gen
Thử thuốc GF tại các nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần có đối
chứng.
Nuôi cấy tế bào BT474, A549
- Chuẩn bị môi trường thử: môi trường được bổ sung đầy đủ được thêm GF ở 3 mức nồng độ (1,5; 3,0 và 6 μg/ml)
- Ống chứng (môi trường bổ sung đầy đủ được thêm NaCl 0,9% cùng thể tích với lượng thuốc thêm vào môi trường thử).
- Tiến hành nuôi tế bào trên các đĩa nghiên cứu (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần có đối chứng đối với mỗi dòng tế bào). Đảm bảo lượng tế bào trên mỗi đĩa là 104, thu tế bào sau 24 giờ.
2.2.2. Tách chiết ARN
Đây là khâu đầu tiên quan trọng trong quy trình đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên mức độ phiên mã gen survivin. Tách chiết ARN phải đảm bảo về hàm lượng và độ tinh sạch. Sử dụng TRIzol để tách theo đúng quy trình thu ARN tổng số để tiến hành các bước tiếp theo của quy trình.
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và đo phổ hấp thụ bằng máy NanoDrop
Các mẫu được xác định nồng độ và độ tính sạch bằng quét phổ hấp thụ và đo OD260, OD280 trên máy NanoDrops theo đúng quuy trình. Độ tinh sạch được xác định dựa vào đỉnh hấp thụ trong phổ hấp thụ của cá mẫu và trị số OD260/280. Mỗi mẫu được tiến hành đo lặp lại 3 lần có đối chứng ứng với mỗi nồng độ. Tiến hành tương tự với dòng tế bào còn lại.
2.2.4. Phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện gen survivin
Với mỗi dòng tế bào, tiến hành real-time RT-PCR định lượng mức độ phiên mã gen với cặp mồi survivin, sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang. Quy trình phản ứng được tiến hành như sau:
- Trộn Mix 1: Thêm 500 ng ARN tổng số + 5 µL 2x QuantiFast Mix 1. Thêm H2O – free ARNse đủ 10,4 µL. Ủ các ống 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp mix 2 STT Thành phần Thể tích (µL) 1 2x QuantiFast Mix2 5 2 Mồi xuôi (F) 1 3 Mồi ngược (R) 1 4 Probe 2 5 QuantiFast RT Mix 0.2 6 H2O – free ARNse 0.4 Tổng thể tích của một phản ứng 9.6
- Trộn đều Mix 1 với Mix 2 sau đó chuyển toàn bộ hỗn hợp phản ứng sang ống PCR có thể tích 20 µL, ly tâm nhẹ. Cuối cùng đặt vào máy Light Cycle® 2.0 của Roche để chạy theo chu trình sau:
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bƣớc Ý nghĩa Nhiệt độ (OC) Thời gian 1 Tạo cADN 50 20 phút 2 Hoạt hóa 95 5 phút 3 Biến tính 95 15 giây
4 Kéo dài 60 30 giây
5 Quay vòng Lặp lại bước 3 và 4: 45 chu kỳ
Trình tự cặp mồi survivin và probe thiết kế như sau, đã được sử dụng và kiểm chứng trong các nghiên cứu trước [50]. Kích thước đoạn gen cần khuếch đại là 121 bps. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi và probe
Mồi và probe Trình tự
Mồi F 5' ACGACCCCATAGAGGAACATA 3'
Mồi R 5' GGACAGAGAAAGAGCCAAGAA 3'
2.2.5. Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR đánh giá biểu hiện gen survivin survivin
Đường biểu diễn chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa số bản copy của tác nhân đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn và giá trị chu kỹ ngưỡng (CP). Xây dựng đường biểu diễn chuẩn nhằm mục đích tính toán được số lượng bản copy ban đầu trong ống phản ứng từ giá trị CP tương ứng.
Công thức tính số lượng bản copy ban đầu của tác nhân đích:
Chu kì ngƣỡng = a . Log lƣợng mARN surviving ban đầu + b => lƣợng mARN surviving ban đầu = 10[(Chu kì ngƣỡng-b)/a]
Tiến hành xây dựng đường chuẩn từ các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ. Pha loãng lượng ARN tổng số theo hệ số 10 sao cho lượng ARN tổng số lần lượt là: 1000 ng/μl, 100 ng/μl, 10 ng/μl, 1ng/μl, 0,1 ng/μl. Do phản ứng real-time RT-PCR là phản ứng nhạy, vì vậy để tránh trường hợp dương tính giả do tạp nhiễm từ môi trường phải có một đối chứng âm NTC( non-template control), mẫu này cũng có đầy đủ các thành phần giống như một phản ứng Real - time PCR chỉ thiếu ARN tổng số. Sau đó, thực hiện phản ứng real-time RT-PCR với cặp mồi survivin .Tiến hành phản ứng RT – PCR sử dụng mồi survivin với các mẫu đã pha, sử dụng phần mềm phân tích trên máy Light Cycle để xây dựng đường chuẩn.
2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin
Vì lượng ARN tổng số tách được ở các mẫu tế bào nghiên cứu không như nhau nên cần hiệu chỉnh lượng ARN tổng số đưa vào phản ứng sao cho không có sự khác biệt về nồng độ ARN giữa các mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng lượng ARN tổng số đầu vào là 500ng. Sau đó tiến hành phản ứng real-time RT- PCR theo quy trình ở phần 2.3.4. Phản ứng khuếch đại có thể quan sát được nhờ tín hiệu huỳnh quang của Taqman probe phát ra khi bám vào sợi ADN mạch kép từ khi phản ứng khuếch đại bắt đầu cho đến khi kết thúc thông qua một hệ thống camera theo dõi tín hiệu phát huỳnh quang từ mỗi ống.
Kết quả thu được là đường phản ứng Realtime RT-PCR và giá trị Chu kỳ ngưỡng CP của các mẫu thử và mẫu chứng cùng với mẫu đối chứng âm (nước). Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng tính được số lượng bản sao gen survivin ban đầu có trong ống phản ứng.
Ngoài ra, có thể sử dụng kết quả Realtime RT-PCR để định lượng tương đối ảnh hưởng của hoạt chất lên gen nghiên cứu dựa trên đơn vị khối lượng. Từ đó có thể kết luận thuốc thử đã làm tăng hay giảm sự biểu hiện gen A đi bao nhiêu lần.
Tỷ lệ biểu hiện gen A [Thử/Chứng] được tính bằng công thức:
Hiệu quả khuếch đại PCR^(Chu kỳ ngƣỡng [C] –Chu kỳ ngƣỡng [T]) (*)
=>Tỷ lệ biểu hiện gen A [Chứng/Thử] được tính bằng công thức:
Hiệu quả khuếch đại PCR^(Chu kỳ ngƣỡng [T] –Chu kỳ ngƣỡng [C]) (**)
Với công thức (*)
Nếu Tỷ lệ biểu hiện gen A [Thử/Chứng] <1 thì thuốc thử đã làm giảm biểu hiện gen so với nhóm chứng.
Nếu Tỷ lệ biểu hiện gen A [Thử/Chứng] >1 thì thuốc thử đã làm tăng biểu hiện gen so với nhóm chứng.
2.2.7. Xử lý thống kê
Các kết quả của nghiên cứu được đưa vào xử lý Thống kê mô tả (Descriptive Statistic) và xử lý T-test (Two-samples Assuming Equal Variances) với α = 0,05 trên phần mềm MS Excel 2016.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả
Kết quả đánh giá tác dụng của glycyl funtumin lên sự phiên mã gen survivin tại các nồng độ khác nhau trên hai dòng tế bào BT474 và A549. Mỗi nồng độ đều được tiến hành lặp lại 3 lần có đối chứng.
3.1.1. Kết quả tách chiết và xác định độ tinh sạch bằng quang phổ hấp thụ
3.1.1.1. Kết quả quét phổ hấp thụ của các mẫu sau tách chiết
Đối với mỗi dòng tế bào, các mẫu ARN sau được tách chiết và quét phổ hấp thụ trên máy NanoDrops với bước sóng từ 220 nm đến 350 nm. Với mỗi mức nồng độ tiến hành đo lần lượt 3 mẫu lặp lại 3 lần song song với đối chứng, kết quả quét phổ hấp thụ thu được như hình 3.1.
Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV của các mẫu ARN chiết từ hai dòng tế bào BT474 và A549
Nhận xét: Đối với cả hai dòng tế bào ung thư vú BT474 và ung thư phổi A549, sản phẩm ARN được tách chiết từ tất cả các mẫu tế bào khi quét phổ tử bước sóng 220 nm đến 350 nm đều chỉ có một đỉnh hấp thụ tại bước sóng 260nm. Kết quả này bước đầu cho thấy sản phẩm ARN thu được khá tinh sạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1.2. Kết quả đo nồng độ và chỉ số OD260/280
Độ tinh sạch của mẫu ARN được xác định dựa vào trị số OD260/280. Mẫu được coi là tinh sạch nếu tỷ lệ này xấp xỉ 2,0.
Nồng độ và các chỉ số OD260, OD280 được đo tự động trên máy NanoDrops và thu được kết quả trong bảng 3.1 và 3.2 đối với hai dòng tế bào BT474 và A549.
Bảng 3.1. Kết quả nồng độ tinh sạch của các mẫu ARN đối với dòng tế bào BT474
Tiến hành tương tự với dòng tế bào A549.
Bảng 3.2. Kết quả nồng độ tinh sạch của các mẫu ARN đối với dòng tế bào A549
Dòng tế bào Mẫu Nồng độ thuốc (μg/ml) Nồng độ ARN tổng số trung bình (μg/ml) OD260/280 trung bình A549 ĐC 462,22 ± 34.02 2,03 ± 0,16 AS1 1,5 472.78 ± 30.36 2,01 ± 0,09 AS2 3,0 455.52 ± 28.78 2,05 ± 0,10 AS3 6,0 379,38 ± 8.64 1,97 ± 0,11 Dòng tế bào Mẫu Nồng độ thuốc (μg/ml) Nồng độ RNA tổng số trung bình (μg/ml) OD260/280 trung bình BT474 ĐC 245,26 ± 18,28 1,95 ± 0,02 AS1 1,5 188,64 ± 22,00 1,95 ± 0,03 AS2 3,0 220,08 ±5,75 1,93 ± 0,02 AS3 6,0 166,28 ± 10,72 1,93 ± 0,001
Nhận xét: Kết quả cho thấy ở tất cả các mẫu đều có tỷ lệ OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. Như vậy, các mẫu ARN tách chiết thu được là tinh sạch chứng tỏ quá trình tách chiết tốt để sử dụng cho các kỹ thuật tiếp theo.
3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng realtime RT-PCR
Từ lượng ARN tổng số đầu vào biết trước ở mẫu chuẩn, pha loãng theo hệ số 10 rồi tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR. Với mỗi mẫu phản ứng, giá trị CP là số chu kỳ nhiệt mà tại đó số lượng bản sao đủ để ống phản ứng cho được tín hiệu huyenhf quang vượt ngưỡng phát hiện của máy, Dựa vào giá trị CP của các mẫu chuẩn, xây dựng đường biểu diễn chuẩn định lượng mARN/cADN survivin và hàm số tương quan giữa các đại lượng, từ đó tính được số lượng bản sao gen survivin ban đầu có trong mỗi ống phản ứng từ các tế bào ung thư BT474 và A549 sau khi nuôi cấy và thử thuốc tại các mức nồng độ khác nhau trong 24 giờ..
Đường biểu diễn chuẩn với mỗi dòng tế bào được thể hiện trong hình 3.2 và 3.3
Hình 3.2. Đƣờng biểu diễn chuẩn trên dòng tế bào BT474
Hình 3.3. Đƣờng biểu diễn chuẩn trên dòng tế bào A549
y = -1.542x + 26.523 R² = 0.9913 0 5 10 15 20 25 30 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Cr o ssi n g Point Log concentration Std curve of A549 Samples Linear (Samples)
Nhận xét: Từ đường biểu diễn hình 3.2 và 3.3, có thể thấy tương quan giữa số lượng bản copy của tác nhân đích ban đầu đưa vào và tín hiệu huỳnh quang thu được. Cả hai mẫu đối chứng âm không chứa ARN của hai dòng tế bào đều không phát hiện thấy tín hiệu huỳnh quang.
3.1.3. Kết quả đánh giá tác dụng của Glycyl funtumin lên mức độ phiên mã gen survivin survivin
3.1.3.1. Tại nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml
Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR với các mẫu thử thuốc tại nồng độ GF 1,5 và 3,0 μg/ml và mẫu đối chứng trên hai dòng tế bào, thu được đồ thị như trong hình 3.4.
Hình 3.4. Đồ thị Realtime RT-PCR tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml
Nhận thấy, tín hiệu huỳnh quang ở tất cả các mẫu đều vượt ngưỡng phát hiện. Như vậy gen survivin biểu hiện ở tất cả các mẫu trong cả nhóm chứng và nhóm thử trên hai dòng tế bào tại hai mức nồng độ này.
Từ giá trị CP - chu kỳ ngưỡng của các mẫu tính ra số lượng bản copies ban đầu của gen survivin sau khi thử thuốc tại các mức nồng độ khác nhau dựa vào đường biểu diễn chuẩn đã xây dựng. Kết quả phân tích thống kê và so sánh tương đối phát hiện sự khác biệt giữa hai nhóm chứng và thử trên hai dòng tế bào được thể hiện trong bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào BT474 tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc
BT474 1 2 3 Nồng độ mARN survivin
trung bình (ng/μl) p
ĐC 314,48 379,44 490,16 394,69 ± 88,83
AS 1.5 342,50 81,65 173,03 199,06 ± 108,07 >0,05 AS 3 533,84 231,29 223,52 329,54 ± 144,49 >0,05
Nhận xét: Đối với dòng tế bào BT474, sau khi thử thuốc tại hai mức nồng độ
1,5 và 3,0 μg/ml, kết quả cho thấy với p > 0,05 ở cả hai mức nồng độ không có sự khác biệt về lượng mARN survivin ban đầu giữa ống thử và ống chứng. Do đó có thể kết luận Glycyl funtumin tại hai mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc không ảnh hưởng tới mức độ phiên mã gen survivin đối trên dòng tế bào này.
Tiến hành tương tự với các mẫu trên dòng tế bào A549 tại mức nồng độ này thu được kết quả như bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào A549 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tại mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc
A549 1 2 3 Nồng độ mARN survivin
trung bình (ng/μl) p
ĐC 49,49 102,88 43,27 65,21 ± 32,77
AS 1.5 22,10 132,61 32,58 62,43 ± 49,81 >0,05 AS 3 27,24 43,92 10,63 27,26 ± 13,59 >0,05
Nhận xét: Đối với dòng tế bào A549, sau khi thử thuốc tại hai mức nồng độ 1,5
và 3,0 μg/ml, kết quả cho thấy với p > 0,05 ở cả hai mức nồng độ không có sự khác biệt về lượng mARN survivin ban đầu giữa ống thử và ống chứng. Do đó có thể kết luận Glycyl funtumin tại hai mức nồng độ 1,5 và 3,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc không ảnh hưởng tới mức độ phiên mã gen survivin đối trên dòng tế bào này.
3.1.3.2. Tại nồng độ 6,0 μg/ml
Phản ứng Realtime RT-PCR được tiến hành tương tự với các mẫu thử thuốc và mẫu đối chứng tại mức nồng độ 6,0 μg/ml. Kết quả đồ thị realtime RT-PCR trên hai dòng tế bào được biểu diễn trong hình 3.5.
Hình 3.5. Đồ thị Realtime RT-PCR tại mức nồng độ 6,0 μg/ml
Nhận thấy, tín hiệu huỳnh quang ở tất cả các mẫu đều vượt ngưỡng phát hiện. Như vậy gen survivin biểu hiện ở tất cả các mẫu trong cả nhóm chứng và nhóm thử trên hai dòng tế bào tại mức nồng độ 6,0 μg/mlnày.
Kết quả phân tích thống kê và so sánh tương đối phát hiện sự khác biệt giữa hai nhóm chứng và thử trên hai dòng tế bào được thể hiện trong bảng 3.5 và 3.6 với mức nồng độ thuốc thử 6,0 μg/ml.
Bảng 3.5. Kết quả định lượng mức độ phiên mã gen survivin trên dòng tế bào BT474
tại mức nồng độ 6,0 μg/ml sau 24 giờ thử thuốc
BT474 1 2 3 Nồng độ mARN survivin trung bình (ng/μl) p ĐC 4827,72 6343,92 9556,09 6909,24± 2414,34 AS 6 194,99 406,25 105,47 235,57 ± 126,10 <0,05
Nhận xét: Đối với dòng tế bào BT474, với mức nồng độ 6,0 μg/ml, kết quả xử lý thống kê cho thấy lượng bản sao gen survivin trong tế bào sau 24 giờ ở nhóm thử giảm so với nhóm chứng (235,57 ± 126,10 ng/μl < 6909,24± 2414,34 ng/μl). Với p < 0,05 chúng ta có thể kết luận mức nồng độ 6,0 μg/ml GF làm giảm lượng bản sao gen survivin ở nhóm thử so với nhóm chứng với độ tin cậy >95% hay đối với dòng tế bào ung thư vú BT474 Glycyl funtumin đã ức chế sự phiên mã gen này tại mức nồng độ