Thí nghiệm khảo sát độ nhạy trên dãy nồng độ DNA vi khuẩn từ 10- 1-10-9, kết quả cho thấy cặp mồi- mẫu dò phát hiện đƣợc vi khuẩn ở ngƣỡng nồng độ 10-5 , đồng nghĩa chỉ với 124 CFU thì quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae.
Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ nhạy
1
2
3 4
5
Hình 4.11: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. (1) đƣờng biểu diễn chứng dƣơng. (2) mẫu 16-389CD. (3) mẫu 16-393CD.(4) mẫu 16-386CD.(5) đƣờng nền
Bảng 4.1:Kết quả chạy trên 40 mẫu Tên chủng 1 16-373CD 2 16-377CD 3 16-378CD 4 16-379CD 5 16-380CD 6 16-381CD 7 16-382CD 8 16-383CD 9 16-384CD 10 16-385CD 11 16-386CD 12 16-387CD 13 16-388CD 14 16-389CD 15 16-390CD 16 16-391CD 17 16-392CD 18 16-393CD 19 16-394CD 20 16-395CD 21 16-396CD 22 16-397CD 23 16-398CD 24 16-399CD 25 16-400CD 26 16-401CD 27 16-402CD 28 16-403CD 29 16-404CD 30 16-405CD 31 16-406CD 32 16-407CD 33 16-408CD 34 16-409CD 35 16-410CD 36 16-411CD 37 16-412CD 38 16-417CD 39 16-418CD 40 16-419CD
Qua bảng thống kê số liệu kết quả 2 quy trình PCR và Realtime PCR ta thấy đƣợc quy trình PCR1 phát hiện đƣợc 3 mẫu dƣơng tính/ 5 mẫu nuôi cấy dƣơng tính hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình PCR2 phát hiện 5 mẫu dƣơng tính trong đó 2 mẫu 16-393 CD và 16-418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy âm tính, hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc 6 mẫu dƣơng tính trong đó có 2 mẫu là 16-393CD và 16-418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy là âm tính, hiệu suất quy trình này đạt khoảng 80%.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN
Bài nghiên cứu so sánh ba phƣơng pháp PCR1, PCR2 và Realtime PCR : PCR1 sử dụng cặp mồi DT1, DT2; PCR2 sử dụng cặp mồi Tox1, Tox 2 và Real time PCR sử dụng mồi ToxA-R, ToxA-F. Trong phƣơng pháp PCR2 ở thí nghiệm khảo sát độ nhạy ta thấy đƣợc cặp mồi Tox1, Tox2 cho kết quả rõ ràng và chính xác hơn khi bổ sung MgCl2. Quy trình PCR1, PCR2 đƣợc thiết lập để có độ đặc hiệu tối ƣu và độ nhạy phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-4 nghĩa là với 2180CFU quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh. Quy trình Real time PCR đƣợc khảo sát cho độ đặc hiệu cao ở nồng độ mồi 0.4µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM quy trình phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-5. Nghĩa là chỉ với 124CFU thì quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh.
Realtime PCR có độ nhạy cao, cho kết quả cụ thể và nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ DNA, Realtime PCR có thể phát hiện ra độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là có thể loại cung cấp thông tin khi phản ứng vừa kết thúc, điều này rất quan trọng trong trƣờng hợp xảy ra sự cố. Realtime PCR cung cấp sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố, do đó có thể rất hữu ích trong việc nghiên cứu, dự đoán và phòng chóng dịch bệnh.
Tuy nhiên bài nghiên cứu chƣa thực hiện khảo sát nồng độ mồi cho hai quy trình PCR1, PCR2. Cần phải thực hiện thêm thí nghiệm này để hoàn thiện hơn 2 quy trình này. Trong thí nghiệm pha loãng nồng độ, chỉ thực hiện pha loãng bậc 10 nên tiến hành thêm pha loãng bậc 2 để nâng cao độ chính xác cho quy trình.
CHƢƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang 209-214 [2]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang212-214 [3]PGS. TS. Lê Văn Phùng. Vi Khuẩn Y Học. Vụ Khoa học và Đào tạo, 2009, trang 126 [4]PGS.TS Lê Văn Phủng. Vi sinh Y học. Vụ khoa học và đào tạo. 2009, trang 130 [5] Xét nghiệm và chuẩn đoán vi khuẩn, NXB y học, 2012, trang105-107
[6]Vi sinh vật gây nhiễm trùng cơ quan (Sách đào tạo Bác sĩ chuyên khoa I dịch tễ học thực địa), NXB Y học, 2012, trang 12
Tài liệu nƣớc ngoài:
[7] DANIEL HAUSER, MICHEL R. POPOFF, MARTINE KIREDJIAN, PATRICE BOQUET AND FRANOIS BIMET. Polymerase Chain Reaction Assay for Diagnosis of Potentially Toxinogenic Corynebacterium diphtheriae Strains: Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay., Journal of Clinical
Microbiology OCt. 1993, p. 2720-2723
[8] Espy, M. J., et al. "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing." Clinical microbiology reviews 19.1 (2006): 165-256.
[9] Hiroshi Nakao, Tanja Popovic . Development of a Direct PCR Assay for Detection of the Diphtheria Toxin Gene. Journal of Clinical Microbiology. , July 1997, p. 1651–1655. 0095-1137/97/$04.0010
[10]Kobaidze, Ketevan, et al. "Direct polymerase chain reaction for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains from the Republic of Georgia after prolonged storage." Journal of Infectious Diseases 181.Supplement_1 (2000): S152- S155.
[11] Mancini, Fabiola, et al. "Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays." Diagnostic microbiology and infectious disease 73.2 (2012): 111-120.
[12] Young, T. Kue. Population health: concepts and methods. Oxford University Press, USA, 2005
[13]Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U. Rapid Detection and Molecular Differentiation of Toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR . Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(7):2485-2489. doi:10.1128/JCM.00452-11
[14]Sing A, Hogardt M, Bierschenk S, Heesemann J. Detection of Differences in the Nucleotide
from Corynebacterium Extrapharyngeal
4851. doi:10.1128/JCM.41.10.4848-4851.2003.
Tài liệu từ internet
CHƢƠNG 7: PHỤ LỤC
Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi DT1, DT2
Lad 373 377 378 379 380 381 + _
- 382 383 384 385 386 387 + lad 388 389 390 391 392 393 + -
- 394 395 396 397 398 399 + lad + 400 401 402 403 404 405 -
- 418 419 + lad
Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi Tox1, Tox2
lad + 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 -
Lad + 412 417 418 419 -
Kết quả chạy Realtime PCR trên mẫu:
378 Chứng dương Hình chạy mẫu 16-373CD, 16-377CD, 16-378CD, 16-379CD, 16-380CD, 16- 381CD Chứng dương 389 393 386 Hình chạy mẫu 16-382CD, 16-383CD, 16-384CD, 16-385CD, 16-386CD, 16- 387CD, 16-388CD, 16-389CD, 16-390CD, 16-391CD, 5616-392CD, 16-393CD, 16-394CD
Chứng dương Hình chạy mẫu 16-394CD, 16-395CD, 16-396CD, 16-397CD, 16-398CD, 16- 399CD, 16-400CD, 16-401CD, 16-402CD, 16-403CD, 16-404CD Chứng dương 418 419 Hình chạy mẫu 16-405CD, 16-406CD, 16-407CD, 16-408CD, 16-409CD, 16-410CD, 16-418CD, 16-419CD