Mục đích là để tìm ra nồng độ thích hợp của cặp mồi ToxA-R, ToxA-F nhằm tiết kiệm đƣợc sinh phẩm mà vẫn cho ra đƣợc kết quả tốt nhất. Nghiệm thức đƣợc thực hiện trên 1 dải nồng độ mồi: 0.8µM, 0.6µM, 0.4µM, 0.2µM, 0.1µM, lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ mồi.
Theo nghiên cứu của Elizabeth A. Mothershed và cộng sự, nghiên cứu năm 2002 báo cáo rằng những tín hiệu huỳnh quang có giá trị Ct dƣới 35 thì cho kết quả dƣơng tính
Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR
Sau khi kết thúc giai đoạn 600C trong 1 phút, tiến hành đọc kết quả. Bảng 3.9: Thành phần phản ứng của phản ứng Realtime PCR Thành phần phản ứng Master Mix Mồi ToxA-R Mồi ToxA-F Rox Probe DNA khuôn mẫu
Nƣớc
3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR
Sử dụng nồng độ mồi đã chọn ở thí nghiệm 3.2.4, khảo sát qua các nồng độ mẫu dò 0.2 µM, 0.1µM, 0.05µM, lặp lại 2 lần cho mỗi nồng độ.
3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR
Tiến hành cấy vi khuẩn C.diphtheriae trên mồi trƣờng BA sau đó thực hiên tách chiết và cấy đếm tƣơng tự ở mục 3.2.2
Sau khi tìm ra đƣợc nồng độ mồi thích hợp tiến hành thực hiện thí nghiệm khảo sát độ nhạy của mồi trên dải nồng độ DNA là 10-1- 10 -7, thí nghiệm đƣợc thực hiện với nồng độ mồi 1.2µM
3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR
Độ đặc hiệu của quy trình PCR mới đƣợc thiết lập sẽ đƣợc kiểm tra bằng các chủng vi khuẩn đƣợc liệt kê ở bảng 3.3 với nồng độ mồi 1.2 µM và nồng độ mẫu dò là 0.1µM
Tiến hành áp dụng quy trình PCR, Realtime PCR chạy trên 40 mẫu ngoáy họng có các triệu chứng lâm sàn và các mẫu ngoáy họng tiếp xúc với ca nhiễm bệnh:
Quy trình PCR (mồi DT1, DT2): nồng độ mồi 0.4µM. Tiến hành điện di sản phẩm PCR trong 35 phút, điện thế 100V
Quy trình PCR (mồi Tox1, Tox2): nồng độ mồi 0.8µM, bổ sung 1µL MgCl2. Tiến hành điện đi sản phẩm PCR trong 30 phút, điện thế 100V
Quy trình Realtime PCR (mồi ToxA-R, ToxA-F): nồng độ mồi 1.2µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ