3.2.1 Tách DNA từ mẫu
Sơ đồ tách chiếc DNA theo bộ QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN của Đức Rửa.thêm 500µl buffer AW1 100µ buffer Lysis+ 20µl protein K + 200µL buffer AL + 260µl Ethanol 99% Ly tâm 8000 rpm/60s Ly tâm 8000 rpm/60s
Các bƣớc tách chiếc thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO
3.2.2 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) phản ứng PCR
Cấy khuẩn C.diphtheriae trên đĩa môi trƣờng BA sau 24h lấy khuẩn lạc tăng sinh trong 2mL BHI broth, sau đó hút 1ml dịch tăng sinh ly tâm 10000 vòng /5 phút thu cặn, tiến hành tách DNA theo quy trình ở mục 3.2.1. 1ml dịch tăng sinh còn lại tiến hành pha loãng từ nồng độ 10-1-10-8 CFU/mL. Chọn hai nồng độ là 10-6 và 10-7 hút 100µL dung dịch cấy trải trên đĩa môi trƣờng BA mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa, 24h sau đếm số khuẩn lạc thu đƣợc trên mỗi đĩa.
Dựa vào nồng độ mồi đƣợc đƣa ra trên các bài báo khoa học trƣớc đây để tìm ra ngƣỡng phát hiện của phản ứng PCR mới thiết lập, quy trình đƣợc kiểm tra trên một dải nồng độ chứng dƣơng vi khuẩn C.diphtheriae nồng độ từ 10-1-10-8CFU/mL thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi nghiệm thức với 2 cặp mồi DT1, DT2 và Tox1, Tox2.
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2
Thành phần phản ứng Master Mix
Mồi DT1 Mồi DT2 DNA khuôn mẫu
Nƣớc Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2
Thành phần phản ứng Master Mix
Mồi Tox1 Mồi Tox2
MgCl DNA khuôn mẫu
Nƣớc
Kĩ thuật PCR khuếch đại các phân đoạn gene của C.diphtheriae đƣợc thực hiện theo trình trình sau:
- Lau tủ an toàn sinh học bằng cồn 70%, bật UV trong 30 phút
- Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất cần thiết và tiến hành pha trộn hỗn hợp phản ứng theo thành phần định sẵn theo bảng trên, ngoại trừ DNA. - Chia đều các hỗn hợp phản ứng cho các tube .
- Chuyển sang các tube phản ứng sang phòng mix DNA và thêm DNA của từng chủng vào các tube đã đƣợc chú thích trƣớc.
- Spin down các tube.
- Đặt các tube phản ứng vào máy PCR đã cài đặt chu trình nhiệt thích hợp và tiến hành phản ứng khuếch đại gene
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2