M methionine * translation stop
THIẾT KẾ MỒI (PRIMER) 1.Mục đích, nguyên tắc
1.Mục đích, nguyên tắc
Mồi (primer) là một thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng PCR (polymerase reaction chain). Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay đầu 3’ của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào hai vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuyếch đại.
Trong phản ứng PCR, bao giờ cũng cần có cặp mồi bao gồm mồi xuôi và mồi ngược. Có rất nhiều tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp mồi như chiều
dài mồi, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi, nhiệt độ bắt cặp… để đảm bảo phản ứng
PCR thành công và thu được sản phẩm khuếch đại (một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA dùng làm khuôn ban đầu). Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế rất tốn thời gian và công sức. Nhờ các phần mềm thiết kế mồi công việc này sẽ trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn.
Một chương trình thiết kế mồi hoàn chỉnh đòi hỏi nhiều chức năng, công cụ tương đối phức tạp và tính lôgic cao. Thông thường chương trình phải đáp ứng được các tính năng như tính được nhiệt độ bắt cặp của mồi, kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc của mồi, kiểm tra sự bắt cặp giữa mồi ngược và mồi xuôi…
Trong phạm vi bài thực tập này, sinh viên tập làm quen với việc thiết kế mồi cho phản ứng PCR dựa vào phần mềm DNAclub (tuy rằng ở phần mềm này, chức năng thiết kế mồi chưa phải là đã hoàn chỉnh)0.
2.Nội dung thực hành
Sinh viên bước đầu làm quen với việc thiết kế mồi cho phản ứng PCR trên phần mềm DNAclub.
3. Thực hành
- Khởi động chương trình DNAclub.
- Kích hoạt menu PCR Primers.
- Chọn Star Primer Selection. Cửa sổ PCR Parameters sẽ được mở ra cho
phép người sử dụng lựa chọn các điều kiện cần thiết cho mục đích nghiên cứu (Hình
- Sau khi nhập vào các điều kiện, chọn Start Selection.
Hình 11.1. Cửa sổ PCR Parameters
Phần mềm sẽ thực hiện công việc kiểm tra, đánh giá các cặp mồi. Các cặp mồi nào có thể đáp ứng được yêu cầu của người sử dụng sẽ được trình bày trên màn hình. Dựa vào đó người sử dụng có thể chọn lựa cặp mồi thích hợp nhất (Hình 11.2.).
4. Bài tập
1.Hãy thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn gen từ vị
trí 1214 đến 3814 trong DNA genome B. Trình tự DNA genome B được lưu trong tập tin genome B thuộc thư mục sequence, ổ đĩa hiện hành.
2.Trong genome của chủng vi sinh vật A, người ta đã xác định được đoạn gen
từ vị trí 670 đến 1638 là vùng gen có tính đặc trưng và bảo tồn cao. Dựa trên cơ sở này, người ta đề ra phương pháp phát hiện nhanh chủng A bằng phương pháp PCR thông qua việc kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen có tính bảo tồn nêu trên. Hãy thiết kế mồi để khuyếch đại đoạn gen nêu trên. Biết rằng trình tự genome của chủng A được lưu giữ trong tập tin genome A1 thuộc thư mục Sequence của ổ đĩa hiện hành.
3.Hãy thiết kế cặp mồi để phát hiện nhanh chủng C bằng phương pháp PCR.
Biết rằng chủng C có trình tự bảo tồn đặc trưng nằm trong vùng 3158-4321 và trình tự genome của chủng C được lưu giữ trong tập tin genome C.
Bài 12.