Ở Việt Nam, nghiên cứu về đặc tính lý hóa cũng như hoạt lực tinh trùng động vật thủy sản được thực hiện từ những năm 2000, chủ yếu được thực hiện trên cá nước ngọt, như:
Hồ Kim Diệp – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (2002) đã nghiên cứu thành công quy trình bảo quản tinh trùng một số loài cá nước ngọt như cá chép, cá trắm cỏ, cá bống, cá Mrigan. Trước khi nghiên cứu bảo quản tinh trùng, nhóm tác giả cũng đánh giá chất lượng tinh trùng nhưng không nghiên cứu sâu về thành phần dịch tương của loài cá nào [5].
Ngoài ra, Nguyễn Minh Thành và ctv (2003) đã bảo quản thành công tinh trùng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dài hạn trong nitơ lỏng. Các tác giả cũng có báo cáo đánh giá chất lượng tinh trùng cá tra về mật độ và hoạt lực nhưng chưa thật sâu sắc [23].
Tiếp đó, Lê Minh Hoàng và Võ Thị Thu Hiền (2012) thực hiện Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpio Linnaeus, 1758 trong nitơ lỏng. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất bảo quản CCSE-2, chất chống đông là DMSO ở nồng độ 10%, quy trình làm lạnh (2) cho kết quả tốt nhất, và không có sự ảnh hưởng của thời gian lên kết quả bảo quản tinh. Nghiên cứu chưa đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản bằng việc cho thụ tinh nhân tạo nhưng cũng đã góp phần cung cấp thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng [16].
Tiếp tục nghiên cứu trên cá chép, Lê Minh Hoàng và Hoàng Hà Giang (2015) đã thực hiện nghiên cứu Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, môi trường và thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá chép. Kết quả thí nghiệm cho thấy, tinh trùng hoạt lực tốt nhất được biểu hiện ở dung dịch với tỉ lệ pha loãng 1:25, NaCl 0,3% và nồng độ thẩm thấu là 100 mOsm/kg. Tuy chưa đánh giá ảnh hưởng của các cation, pH và nhiệt độ lên hoạt lực tinh trùng cá chép, nhưng cũng đã góp phần cung cấp số liệu để hoàn chỉnh các điều kiện tối ưu áp dụng trong bảo quản tinh cá chép và những loài cá xương khác [11].
Gần đây, cũng trên tinh trùng cá chép, Lê Minh Hoàng và Phạm Phương Linh (2016) đã thực hiện nghiên cứu Ảnh hưởng của nồng độ cation (K+, Ca2+) và việc tiêm hormone kích thích sinh sản lên hoạt lực tinh trùng cá chép Cyprinus carpio. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, hoạt lực tinh trùng cá chép tốt nhất ở nồng độ cation K+ là 50 mM, Ca2+ là 2,5 mM; những thông số hoạt lực trước và sau khi kích thích sinh sản bằng LHRHa sau 6h và 12h cho thấy không có sự khác biệt đáng kể. Kết quả của thí nghiệm góp phần cung cấp các số liệu giúp chúng ta tạo ra một môi trường tốt nhất cho hoạt lưc tinh trùng cá chép [132].
Cho đến thời điểm này, nghiên cứu về tinh trùng trên các loài cá biển được quan tâm và thực hiện bởi các tác giả như:
Võ Thị Ngọc Giàu (2014) đã thực hiện Đánh giá chất lượng tinh trùng cá dìa
Siganus guttatus (Bloch, 1787) nuôi tại Nha Trang - Khánh Hòa. Theo đó, nghiên cứu tìm ra tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá dìa (Siganus guttatus Bloch, 1787) cụ thể lần lượt như sau: tinh trùng cá dìa hoạt lực tốt nhất ở tỷ lệ pha loãng 1:50, pH = 8 và nồng độ thẩm thấu 400 mOsm/kg trong nước biển nhân tạo [33].
Lê Minh Hoàng và ctv (2015) đã thực hiện nghiên cứu Đặc tính lý học của tinh trùng cá dìa. Kết quả là trong dịch tương của cá dìa chứa 169,46±4,35 mmol/l ion Na+; 6,1±0,27 mmol/l ion K+; 144,65±2,98 mmol/l ion Cl-; 09±0,39 mmol/l ion Ca2+; 15,55±1,67 mmol/l ion Mg2+; tổng protein 1,44±0,03 (g/l); nồng độ thẩm thấu 355,91±7 (mOsm/kg). Trung bình thể tích tinh dịch 0,86±0,22 (ml/con); mật độ tinh trùng 9,69±1,45 (x109 tt/ml); độ quánh 91,71±3,35 (%) [15].
Lê Minh Hoàng và Nguyễn Địch Thanh (2015) đã thực hiện nghiên cứu Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, pH và nồng độ thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng cá hồng bạc (Lutjanus argentimaculatus Forskal, 1775). Kết quả cho thấy, các thông số hoạt lực tốt nhất của tinh trùng quan sát được khi pha loãng tinh dịch ở tỷ lệ 1:100, pH = 8,0 và nồng đô thẩm thấu là 500 mOsm/kg. Các kết quả này có thể đóng góp hữu ích trong việc hoàn thiện các phương pháp bảo quản tinh trùng ở không chỉ cá Hồng bạc mà còn ở các loài cá xương biển khác [12].
Lê Minh Hoàng và Đặng Hoàng Trường (2015), thực hiện nghiên cứu Vai trò của kháng sinh đến hoạt lực tinh trùng cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) sau khi bảo quản trong tủ lạnh. Kết quả cho thấy hoạt lực tinh trùng tốt nhất ở nghiệm thức bổ sung
200ppm Neomycin. Ở nghiệm thức này hoạt lực tinh trùng có thể duy trì hoạt động cho đến ngày thứ 36 trong điều kiện bảo quản ở tủ lạnh [10].
Lê Minh Hoàng và Phạm Quốc Hùng (2016) đã thực hiện nghiên cứu Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng, chất bảo quản và nhiệt độ đến chất lượng tinh trùng cá mú cọp bảo quản trong tủ lạnh. Kết quả cho thấy, tinh trùng cá mú cọp bảo quản trong tủ lạnh bằng chất bảo quản ASP với tỷ lệ 1:3 ở nhiệt độ 4oC cho chất lượng tốt nhất và tinh trùng có thể duy trì đến ngày thứ 24. Kết quả này cho thấy, tinh trùng cá mú cọp có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ thấp [13].
Trên cá chẽm mõm nhọn, đã có một số nghiên cứu bước đầu như:
Nguyễn Thị Hồng Nhung (2013) đã có công trình nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng và ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis. Tác giả bước đầu đưa ra được các thông số cơ bản và đánh giá được chất lượng tinh trùng của cá chẽm mõm nhọn như các đặc tính lý hóa sinh và xác định được các yếu tố tối ưu cho hoạt lực tinh trùng [25].
Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis
trong tủ lạnh được thực hiện bởi Bông Minh Đương (2013). Kết quả nghiên cứu đã xác định được loại chất bảo quản tốt nhất cho tinh trùng cá chẽm mõm nhọn trong tủ lạnh là ASP (dịch tương nhân tạo), nhiệt độ thích hợp là 2oC, thời gian tồn tại của tinh trùng có thể kéo dài đến ngày thứ 24 với hoạt lực 9,44%, vận tốc 56,44µm/s. Việc bổ sung kháng sinh cũng có thể kéo dài thời gian tồn tại của tinh trùng trong tủ lạnh: bổ sung Neomycin (200ppm), hoạt lực tinh trùng có thể kéo dài hoạt lực đến ngày thứ 30, hoạt lực 9,44%, vận tốc 63,11 µm/s; bổ sung Gentamycin (200ppm), hoạt lực tinh trùng kéo dài đến ngày thứ 36, hoạt lực 3,56%, vận tốc 54,67µm/s; bổ sung Penicillin và Streptomycin (200 ppm) hoạt lực tinh trùng có thể kéo dài đến ngày thứ 30, hoạt lực 2,22%, vận tốc 52,89 µm/s [1].
Tác giả Nguyễn Thị Thanh Thủy (2014) đã thực hiện Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828) trong nitơ lỏng. Kết quả nghiên cứu cho thấy tinh trùng cá chẽm mõm nhọn được bảo quản trong nitơ lỏng theo quy trình làm lạnh 2 bước bằng dung dịch ASP (dịch tương nhân tạo), và DMSO 10% ở tỷ lệ pha loãng 1:3 được xem như là chất chống đông, cho kết quả tốt nhất với
hoạt lực và vận tốc lần lượt là 84,89±1,21% và 137,22±1,12µm/s. Tỷ lệ thụ tinh sau 1 năm là 65,13±1,31% [26].
Nghiên cứu xác định đặc tính lý hóa sinh và hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis (Cuvier & Valencienes, 1828) thông qua thời điểm thu mẫu trong mùa vụ sinh sản được thực hiện bởi Vũ Thái Hòa (2015). Kết quả thí nghiệm cho thấy, thu mẫu ở thời điểm giữa vụ cho chất lượng tinh trùng tốt nhất [34].
Tiếp đó, Lê Minh Hoàng và Phạm Quốc Hùng (2016) đã thực hiện nghiên cứu Đánh giá hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis bảo quản trong tủ lạnh thông qua mùa vụ sinh sản. Kết quả thu được cho thấy tinh trùng được pha loãng với tỷ lệ 1:3 và bổ sung 200ppm Gentamycin cho hoạt lực tốt nhất vào đầu và giữa vụ sinh sản, trong khi đó tinh trùng thu ở cuối vụ sinh sản cho hoạt lực tốt nhất ở tỷ lệ 1:5 và 300ppm Gentamycin [14].
Từ những kết quả của các công trình nghiên cứu cho thấy, dù đã có một vài nghiên cứu liên quan đến tinh trùng cá chẽm mõm nhọn, tuy nhiên tính đến thời điểm này chưa có bất kỳ một nghiên cứu nào đánh giá đặc tính lý học, sinh hóa, hoạt lực và cấu trúc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn thông qua việc tiêm hormone kích thích sinh sản – một trong những yếu tố quyết định thành công của sản xuất giống nhân tạo. Do vậy, nghiên cứu “Ảnh hưởng của hormone kích thích sinh sản lên đặc tính lý hóa sinh, hoạt lực và cấu trúc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier và Valenciennes, 1828)” được thực hiện sẽ làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sau này để hoàn thiện cũng như nâng cao hiệu quả sản xuất giống nhân tạo cá chẽm mõm nhọn tại Việt Nam.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 4 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm NORAD, Viện Nuôi trồng thủy sản.
Đối tượng nghiên cứu: Tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis
(Cuvier và Valenciennes, 1828).
2.2. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Sơ đồ khối tổng quát nội dung nghiên cứu:
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu.
Xác định loại, liều lượng, thời gian sau khi tiêm hormone tốt nhất cho cá chẽm mõm nhọn Đánh giá chất lượng tinh trùng
Đánh giá đặc tính lý học: Thể tích, mật độ, độ quánh, tổng số tinh trùng Đánh giá đặc tính sinh hóa: Ion,
protein tổng số, pH, NĐTT
Đánh giá hoạt lực: Phần trăm
hoạt lực, vận tốc, thời gian hoạt
lực
Đánh giá cấu trúc tinh trùng Trước khi tiêm 0h Sau khi tiêm 24h Sau khi tiêm 48h Sau khi tiêm 72h
Tiêm DOM 20 mg/kg (4 con) Tiêm LHRHa 20 µg/kg (4 con) Tiêm LHRHa 80 µg/kg (4 con) Tiêm HCG 500 IU/kg (4 con) Tiêm HCG 1000 IU/kg (4 con) Tiêm HCG 1500 IU/kg (4 con) Tiêm LHRHa 50 µg/kg (4 con)
Ảnh hưởng của hormone lên đặc tính lý hóa sinh, hoạt lực và cấu trúc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
2.2.2. Cá đực và thu tinh
Cá chẽm mõm nhọn trưởng thành được thu gom tại Vịnh Nha Trang giữa tháng 02 đến tháng 11 năm 2012. Sau đó, cá được vận chuyển đến lồng nuôi có kích cỡ 4x4x3m tại Vũng Ngán, Nha Trang, Khánh Hòa. Mặt trên của lồng được bao phủ bởi lưới bảo vệ để cá không nhảy ra ngoài. Cá bố mẹ được cho ăn hàng ngày với cá tạp được bổ sung vitamin E với khẩu phần cho ăn là 5% khối lượng cơ thể cá cho đến khi cá thành thục để tiến hành thí nghiệm. Kích cỡ cá đực sử dụng cho các thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.1.
Cá đực được gây mê bằng Ethylene glycol monophenylether với liều lượng 200 ppm trước khi thu tinh dịch. Tinh dịch được thu bằng cách ấn nhẹ bụng cá từ phía trước ra phía sau. Tinh dịch chảy ra cho thẳng vào ống nhựa 1,5 ml (đã được khử trùng và sấy khô) có đậy nắp. Trong quá trình thu tinh dịch, bụng cá và xung quanh lỗ huyệt sinh dục được lau bằng khăn sạch để tránh lẫn tạp tinh dịch với nước tiểu, phân, máu và nhớt cá. Ồng tinh dịch sau khi thu xong ngay lập tức bảo quản trên đá khô cho đến khi sử dụng phân tích các thông số đặc tính lý học của tinh dịch, đặc tính sinh hóa của dịch tương, hoạt lực, và cấu trúc tinh trùng cá chẽm mõm nhọn.
Bảng 2.1. Kích cỡ cá đực được sử dụng cho các thí nghiệm (n=4) NMSL 0,9 % DOM 20 mg/kg LHRHa (µg/kg) HCG (IU/kg) 20 50 80 500 1000 1500 W (g) 562,5± 137,7 587,5± 175,0 550,0± 129,1 587,5± 103,1 575,0± 86,6 525,0± 150,0 537,5± 137,7 562,5± 149,3 L (cm) 26,8±1, 4 26,9±1,7 26 ,8±1,4 27,0±1,1 27,0±1,1 26,5±1,6 26,5±1,4 26,6±1,4
W: Khối lượng (g); L: Chiều dài (cm); NMSL: Nước muối sinh lý
2.2.3. Hormone và liều lượng sử dụng
Tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm (trước khi tiêm hormone) (0h), 32 con cá đực được chọn ngẫu nhiên cho quá trình thu tinh như được mô tả ở trên. Sau đó, 28 con cá đực được lựa chọn ngẫu nhiên để tiêm vào gốc vây bụng với từng loại kích thích tố như 20 mg/kg KL Domperidone (DOM) hoặc 20, 50, 80 µg/kg KL Luteinizing Hormone Releasing Hormone analog (LHRHa) (Lam Hua Dragon Co. Ltd., Hong Kong) hoặc 500, 1000, 1500 IU/kg KL Human Chorionic Gonadotropin (HCG) (Ningbo Renjian
Pharmaceutical Co.,Ltd, China). Liều lượng hormone được sử dụng trong nghiên cứu này là dựa vào các nghiên cứu trước của Mañanósvà ctv (2009), Le MH và Pham QH (2016), Pham QH và ctv (2007a) trên các loài cá biển nuôi vùng nhiệt đới [133, 146, 170]. 4 con cá đực còn lại được tiêm nước muối sinh lý 0,9% như là thí nghiệm đối chứng. Cá đực sau khi tiêm xong thì mỗi con được lưu giữ tại các lồng lưới nhỏ (1x1x3m) riêng biệt để dễ dàng cho thao tác thu thập tinh dịch. Tinh dịch được thu trước thời điểm tiêm hormone (0h) để đánh giá đặc tính lý học của tinh trùng, hóa sinh của dịch tương, hoạt lực và cấu trúc của tinh trùng đầu tiên và thu tại thời điểm 24, 48, và 72 h sau khi tiêm hormone để đánh giá ảnh hưởng của hormone lên các đặc tính tương tự như tại thời điểm 0h. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 4 lần (tương đương 4 con cá chẽm mõm nhọn đực).
2.2.4. Xác định đặc tính lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn
Đặc tính lý học bao gồm thể tích tinh dịch (ml/cá đực), mật độ tinh trùng (×109 tinh trùng/ml) , độ quánh tinh dịch (%), và tổng số tinh trùng (×109 tinh trùng/cá đực).
Các thông số đặc tính lý học của tinh dịch ở nghiên cứu này được xác định dựa theo các nghiên cứu trước đó của Le MH và ctv (2011a), Le MH và ctv (2014) [129, 131].
Thể tích tinh dịch: được xác định bằng ống eppendorf có chia vạch thể tích nhỏ nhất đến 0,05 ml.
Mật độ tinh trùng: được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Haematocymetes (Marienfeld, Germany) trên kính hiển vi có độ phóng đại 400× (Olympus BX41TF, Tokyo, Japan). Tinh dịch được pha loãng trong tube với tỷ lệ pha loãng là 1:1000 (hút 1μl tinh dịch cho vào 999 μl 0,9% NaCl), lắc đều sau đó hút tinh dịch đã pha loãng cho một ít lên buồng đếm hồng cầu đã chuẩn bị sẵn. Đếm tinh trùng trong các khu đếm hồng cầu (đếm tổng số tinh trùng trong 4 khu đếm ở 4 góc và 1 khu ở giữa), mỗi khu gồm 16 ô nhỏ. Mật độ tinh trùng được xác định theo công thức:
M =A∗4000∗R∗1000
80
Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch (Tt/ml) A: Tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm
1000: Hệ số pha loãng 80: Tổng số ô đếm
4000: Số nghịch đảo thể tích dung dịch của 1 ô
Độ quánh tinh dịch: Được xác định bởi Hawksley micro – hematocrit reader (Sons Ltd., England).
Tổng số tinh trùng (TSTT): Được xác định dựa trên bởi số liệu của thể tích tinh dịch và mật độ tinh trùng.
TSTT (×109 tinh trùng/cá đực) = Thể tích tinh dịch * Mật độ tinh trùng Xác định đặc tính lý học của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn được minh họa bằng sơ đồ sau đây:
2.2.5. Xác định đặc tính sinh hoá của dịch tương
Đặc tính sinh hóa của dịch tương bao gồm nồng độ các ion (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-), protein tổng số, pH và nồng độ thấm thấu.
Các thông số đặc tính sinh hóa của dịch tương cá chẽm mõm nhọn trong nghiên cứu này được xác định dựa theo các nghiên cứu trước đó của Le MH và ctv (2011a), Le MH và ctv (2014) [129, 131].
Để tiến hành xác định các đặc tính sinh hóa này, tinh dịch được cho vào 1,5 eppendorf tube rồi sau đó li tâm (15.000 rpm) khoảng 10 phút. Sau khi li tâm thì tiến hành tách phần dịch tương ở phía trên rồi tiến hành xác định pH và nồng độ thẩm thấu. pH được xác định bằng máy đo pH (pH test, Romania). Nồng độ thẩm thấu được xác định bằng máy đo nồng độ thẩm thấu (Advandced Instrµments Inc., USA). Các đặc tính
Tinh dịch
Mật độ của tinh trùng Thể tích của tinh
trùng
Ly tâm: 15.000 rpm khoảng 10 phút
1.5 ml Eppendorf tube 75 mm capillary
Đặc tính hóa sinh Độ quánh