Davis và cộng sự [28] đã biểu hiện gen HA của virus cúm người (H1N1) trong tế bào E. coli. Kháng nguyên tái tổ hợp HA0 có thể gắn chuyên biệt với kháng thể kháng virus thông qua việc ức chế cạnh tranh với HA của virus. Jabbar và cộng sự [41] đã biểu hiện gen HA của virus cúm người (H1N1) trên bề mặt tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae, protein này có thể được nhận diện bởi kháng thể kháng HA của virus thông qua phản ứng tủa miễn dịch. Saelens và cộng sự [63] đã biểu hiện gen
HA từ virus cúm A H3N2 (A/Victoria/3/75) trong nấm men Pichia pastoris, HA tái tổ hợp được tiết vào trong môi trường nuôi cấy và có thể bảo vệ chuột khi được kích thích với liều 10LD50 của virus H3N2 (A/Victoria/3/75). Nwe và cộng sự [59] đã biểu hiện tiểu phần HA1 của virus cúm H5N1 trong hệ thống baculovirus/côn trùng. Protein HA1 này có khả năng tạo được kháng thể ở lợn và kháng thể này nhận diện được virus H5N1.
Một vắc-xin đã được cấp patent số 7192595 (20/03/2007), là hỗn hợp bao gồm bốn epitope b ảo tồn của virus cúm được biểu hiê ̣n dư ới dạng dung hợp với kháng nguyên khuẩn mao củ a Salmonella. Kết quả thử nghiê ̣m cho thấy v ắc-xin này có hiê ̣u quả b ảo vệ trên mô ̣t số chủng virus cúm H 1, H2, H3 [18]. Mô ̣t nghiên cứu khác tâ ̣p trung vào vùng bảo tồn trê n phần thân thẳng của protein HA . Kết quả cho th ấy, kháng nguyên tái tổ hợp này cũng tạo đáp ứng miễn di ̣ch b ảo vệ đối với mô ̣t số chủng virus cúm H1, H2, H3 và H5. Các kết quả này làm nền tảng cho viê ̣c phát triển mô ̣t loa ̣i v ắc- xin phổ rô ̣ng phòng virus cúm gia cầm độc lực cao hiện nay [70].
Các vắc-xin phổ rộng dựa trên các epitope bảo tồn cũng đang được tiến hành ở nhiều mức độ khác nhau và đã đạt được một số thành tựu nhất định (Bảng 1.2). Các kết quả mở ra tiềm năng phát triển cho nền công nghiệp vắc-xin Việt Nam và thế giới. Tuy nhiên, các công ty chỉ đang trên bước đường thử nghiệm lâm sàng trên người nên Việt Nam có khả năng bắt kịp và sản xuất đủ phục vụ nhu cầu trong nước [19].
1.5.2. Các vắc-xin phòng cúm A/H5N1 đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam
a. Các nghiên cứu vắc-xin phòng cúm A/H5N1
Các chủng giống virus cúm A/H5N1 được phân lập tại Việt Nam là nguồn gen cho các nghiên cứu tạo vắc-xin thế hệ mới phòng cúm A/H5N1 cho người và gia cầm
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất vắc-xin dựa trên các trình tự bảo tồn của virus cúm ở một số công ty lớn trên thế giới
trên thế giới. Trong đó ba chủng virus tái tổ hợp NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) có nguồn gốc gen H5 và N1 từ các chủng virus cúm A/H5N1 Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004 hoặc A/Vietnam/1203/2004) đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vắc-xin. Hiện nay, Việt Nam đã sử dụng chủng NIBRG-14 do Viê ̣n NIBSC – Vương quốc Anh cung cấp để sản xuất vắc-xin cúm gia cầm A/H5N1 cho gia cầm bằng công nghệ phôi trứng gà. Chủng vắc-xin NIBRG-14 là chủng virus nhược độc tái tổ hợp thuộc clade 1 được tạo bằng công nghệ di truyền ngược, mang 2 gen HA và NA từ chủng A/Vietnam/1194/2004(H5N1) và 6 gen còn lại từ chủng A/Puerto Rico/8/34(H1N1), trong đó gen HA đã được biến đổi di truyền bằng cách cắt bỏ ba acid amin Arginine (R), 1 acid amin Lysine (K) và thay thế Lysine (K) bằng Threonine (T), ở vị trí 327-328, là vị trí phân cắt của HA thành HA1 và HA2, góp phần quy định độc lực của virus [36] [73] [75]. Ưu điểm của chủng vắc-xin này là có thể tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, có thể bảo vệ được vật chủ khỏi sự tấn công của virus cúm mùa và các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 1, 1.1. Tuy nhiên vắc-xin này không tạo được hiệu quả bảo vệ đối với các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc các clade khác như 2.3.4 hay 2.3.2.1b.
Hiện nay, chủng NIBRG-14 đã được Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) sản xuất vắc- xin để phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 cho gia cầm và vật nuôi, vắc-xin phòng cúm A/H5N1 cho người vẫn còn trong giai đoạn thử nghiệm.
Năm 2007, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã phát triển kỹ thuật sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát. Vắc-xin này sử dụng một chủng tái tổ hợp từ chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với một chủng tái tổ hợp từ chủng virus do Đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp. Hiện nay, Viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 để sản xuất vắc-xin cho người và đang nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng [14].
Viện Pasteur TP. HCM nghiên cứu phát triển dạng vắc-xin nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14 [11].
Từ năm 2006, Trường ĐH KHTN, ĐHQG-TP.HCM đã thu nhận các gen kháng nguyên virus cúm gia cầm A/H5N1 từ đợt dịch cúm gia cầm vào cuối năm 2004 và tạo ra một số kháng nguyên virus cúm H5N1 tái tổ hợp như HA-GST, NA-GST, M1, M2e, NS1, NS2. Năm 2008, nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu ứng dụng các công cụ Tin Sinh học để dự đoán các epitope bảo tồn từ các kháng nguyên virus cúm A/H5N1, hướng tới sàng lọc kháng nguyên tiềm năng phục vụ phát triển vắc-xin phòng cúm gia cầm A/H5N1 phổ rộng [1] [5] [6] [12].
b. Các vắc-xin phòng cúm A/H5N1 đang đƣợc ứng dụng
Cho đến nay, Việt Nam phải nhập các vắc-xin phòng cúm A/H5N1 từ nước ngoài. Năm 2010 Việt Nam đã bước đầu sản xuất vắc-xin cho gia cầm, chưa có vắc-xin phòng cúm A/H5N1 cho người.
Các vắc-xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm đang được sử dụng hiện nay gồm: - Vắc-xin Trovac AIV H5: là vắc-xin virus đậu sống tái tổ hợp chứa gen HA của chủng A/turkey/Ireland/1378/83/H5N8.
- Vắc-xin vô hoạt Nobilis influenza H5N2 (Hà Lan)
- Vắc-xin vô hoạt H5N2 chủng N28 của Công ty Phát triển Công nghệ Sinh học Harbin Weike (Trung Quốc)
- Vắc-xin vô hoạt H5N1 chủng Re-1 Strain của Công ty Phát triển Công nghệ Sinh học Harbin Weike (Trung Quốc)
- Vắc-xin vô hoạt H5N9 của Merial sử dụng tiêm phòng cho ngan
- Vắc-xin nhũ dầu cúm gia cầm chủng NIBRG-14 do Việt Nam sản xuất đã được sử dụng để phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm.
1.6. NGUYÊN LÝ CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN Ở VẬT CHỦ
Việc đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tùy thuộc vào con đường gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên trong cơ thể vật chủ. Nếu được tạo thành từ những epitope được nhận diện bởi tế bào B, kháng nguyên sẽ gây đáp ứng miễn dịch dịch thể, kích thích tế bào B tạo kháng thể. Ở trường hợp này, các phương pháp đánh giá miễn dịch dịch thể được sử dụng. Nếu kháng nguyên được tạo thành từ những epitope nhận diện bởi các tế bào T thì các phương pháp đánh giá miễn dịch tế bào được sử dụng.
1.6.1. Phƣơng pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua đáp ứng miễn dịch dịch thể ở vật chủ
Để đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch dịch thể của epitope tế bào B trong vật chủ, các phương pháp ELISA, Western blot, CBA... được dùng phổ biến. Nguyên tắc chung của các phương pháp này là đánh giá khả năng tạo thành kháng thể đặc hiệu hiện diện trong huyết thanh động vật thí nghiệm đã được gây đáp ứng miễn dịch bằng kháng nguyên thử nghiệm.
a. ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzym) là một kỹ thuật sinh hóa dùng để phát hiện và định lượng một protein cụ thể (kháng nguyên, kháng thể, …) trong một hỗn hợp phức tạp. Cơ sở của phương pháp này là dựa trên việc đánh dấu kháng nguyên hay kháng thể bằng cách cộng gộp với một enzym và cho phép phát hiện các phức hợp miễn dịch tạo thành trên một pha rắn [25].
Phương pháp ELISA gồm các dạng ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp hay ELISA cạnh tranh. Nhằm phát hiện sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu kháng nguyên trong kháng huyết thanh vật chủ, dạng ELISA kháng thể gián tiếp thường được sử dụng. Ở phương pháp ELISA dạng này, kháng nguyên được cố định trên giá thể, mẫu huyết thanh cần thử nghiệm được bổ sung vào giếng, sau đó kháng thể cộng hợp
enzym được bổ sung. Cơ chất của enzym tương tác với enzym tạo sản phẩm có màu có thể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc đo bằng mật độ quang [25], [88].
b. Western blot
Western blot (Western Blotting) là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng thể để phát hiện protein mục tiêu từ hỗn hợp protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang. Western blot được mô tả bởi Towbin và cộng sự năm 1979, đã trở thành một kỹ thuật thông dụng để phân tích protein, cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau [91] [92].
c. Cytometric bead array (CBA)
CBA là một kỹ thuật ứng dụng dòng cytometry cho phép định lượng đồng thời nhiều protein. Nguyên tắc của kỹ thuật CBA là sử dụng các đầu dò huỳnh quang và các hạt được phủ kháng thể bắt để phân tích dòng chảy tế bào. Mỗi hạt trong hỗn hợp sẽ phát huỳnh quang ở một bước sóng nhất định khi hỗn hợp hạt di chuyển đồng thời qua cột phân tách tế bào. Phương pháp này làm giảm đáng kể về số lượng và thời gian phân tích mẫu so với một số phương pháp khác như ELISA hay Western blot [93].
1.6.2. Phƣơng pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua đáp ứng miễn dịch tế bào ở vật chủ
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là quá trình miễn dịch được thực hiện qua trung gian của tế bào T. Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào khác với đáp ứng miễn dịch dịch thể ở chỗ không tạo ra kháng thể và do đó không thể đánh giá được bằng các phương pháp thông thường như ELISA hay Western Blot. Do vậy, tính sinh miễn dịch của các epitope tế bào T được đánh giá thông qua sự hoạt hóa, kích thích tế bào T như là: (i) khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào; (ii) khả năng tiết các cytokin hay (iii) khả năng gây độc tế bào. Các phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của tế
bào T bao gồm: ELISPOT, intracellular cytokine staining (ICS), đánh giá kích thích tăng sinh tế bào bạch cầu bằng phóng xạ, CFSE staining…
a. ELISPOT
ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) là phương pháp dùng để giám sát các đáp ứng miễn dịch trên người và động vật, được phát triển bởi Cecil Czerkinsky năm 1983. ELISPOT ban đầu được phát triển để đếm các tế bào lympho B tạo ra kháng thể trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, và sau đó được cải biến để phù hợp với nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt là trong việc phát hiện các tế bào riêng biệt sản xuất các cytokin đặc hiệu. Trong điều kiện thích hợp, thử nghiệm ELISPOT cho phép xác định sản phẩm của quá trình tương tác các tế bào đã hoạt hóa hoặc các tế bào đáp ứng tiết ra, hình thành đốm trên màng PVDF [44], [74].
Quy trình thực hiện ELISPOT (Hình 1.4) gồm các bước:
- Cố định kháng thể: kháng thể đơn dòng đặc hiệu với cytokin được giữ cố định trong một pha rắn (đĩa ELISPOT 96 giếng với màng polyvinyl-difluoride- PVDF). Các vị trí không gắn với kháng thể kháng cytokin được khóa bởi một protein huyết thanh không phản ứng với kháng thể;
- Bổ sung hỗn hợp tế bào và tác nhân kích thích: những tế bào đã được kích thích phù hợp được thêm vào giếng và được ủ CO2 ẩm ở 37oC trong một khoảng thời gian xác định. Trong suốt quá trình ủ, các tế bào được hoạt hóa nhờ các tác nhân kích thích bắt đầu sản xuất và tiết ra cytokin. Cytokin này gắn ngay lập tức với các kháng thể ở vùng lân cận với tế bào tiết cytokin đã được cố định trong giếng ở Bước 1;
- Phát hiện: sau khi rửa sạch tế bào và các phần tử không được gắn, một kháng thể đa dòng có gắn biotin đặc trưng cho cytokin được thêm vào giếng. Kháng thể này phản ứng với một epitope riêng biệt của cytokin mục tiêu và giúp phát hiện được các cytokin đã bị bắt giữ;
- Sau đó, alkaline-phosphatase cộng hợp với streptavidin được thêm vào, Enzym không được gắn được rửa đi và 1 cơ chất tan được thêm vào;
- Một chất kết tủa xanh đen (một đốm có màu) được hình thành tại các vị trí của các tế bào tiết cytokin.
- Đếm số lượng các đốm trong các giếng nuôi tế bào có tác nhân kích thích và không có tác nhân kích thích, để xác định tần suất các tế bào đáp ứng với tác nhân kích thích.
Trong thử nghiệm ELISPOT, các đối chứng đóng vai trò rất quan trọng. Đối chứng âm là giếng nuôi tế bào không có kháng nguyên hoặc tác nhân kích thích. Đối
Hình 1.4. Quy trình ELISPOT điển hình.
j. Ghi nhận các đốm dương tính dưới kính hiển vi
j. Ghi nhận các đốm dương tính dưới kính hiển vi
chứng dương là giếng nuôi tế bào có chứa tác nhân kích thích đa dòng tế bào T, thường sử các kháng thể đặc hiệu của CD3. Đa số các cytokin của tế bào T bao gồm IFN-γ, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-10 và IL-13 đều được tạo ra bởi tác nhân kích thích này. Một số các tác nhân kích thích khác cũng thường được sử dụng bao gồm phytohemagglutinin (PHA) và concanavalin A [65] [74].
b. INTRACELLULAR CYTOKINE STAINING (ICS)
ICS là kỹ thuật nhuộm cytokin nội bào cho phép đánh giá các tế bào riêng biệt trong 1 quần thể và không phụ thuộc vào sự phát hiện loại cytokin tiết. Kỹ thuật này có thể được sử dụng đồng thời với nhuộm bề mặt để cho phép xác định và mô tả các tế bào tiết cytokin riêng biệt. Nồng độ cytokin ngoài môi trường hay trong tế bào được xác định nhờ kháng thể kháng cytokin liên kết với chất huỳnh quang thông qua kỹ thuật Flow Cytometry. Quy trình thực hiện ICS bao gồm các bước: hoạt hóa tế bào, thu nhận tế bào, khóa thụ thể Fc, nhuộm các kháng nguyên bề mặt tế bào, cố định tế bào, phân tích Flow Cytometric [37].
c. Đánh giá kích thích tăng sinh tế bào bạch cầu của kháng nguyên
Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào dựa trên khả năng kích thích tăng sinh tế bào T có thể được thực hiện bằng bốn phương pháp: đếm số tế bào, định lượng sự tổng hợp DNA, đếm số chu kỳ tế bào và theo dõi sự phân bào bằng huỳnh quang; trong số này, phương pháp hiệu quả nhất là phát hiện sự gia tăng tổng hợp DNA qua trung gian 3H-thymidin. Trong phương pháp này, tế bào T được nuôi cấy chung với yếu tố kích thích trong 3-5 ngày. Sau đó, một lượng nhỏ 3H-thymidin được thêm vào môi trường nuôi cấy. Nếu hiện tượng tăng sinh tế bào T xảy ra, 3H-thymidin được tế bào sử dụng để tổng hợp DNA và do đó được giữ lại trong nhân tế bào. Sau vài giờ nuôi cấy, dịch nuôi cấy được loại bỏ, sinh khối tế vào được thu nhận. Lượng 3H được giữ lại trong nhân được đánh giá bằng cường độ phát xạ, với đơn vị là số lần phát xạ/phút. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, tuy nhiên do phải sử dụng đồng vị phóng xạ nên hiện nay không còn được thông dụng [47] [54].
d. Phƣơng pháp nhuộm bằng CFSE
Carboxy fluorescein succinimidyl ester (CFSE) là một thuốc nhuộm huỳnh quang có thể sử dụng để đánh dấu tế bào lympho T và theo dõi quá trình di chuyển của chúng trong cơ thể vật chủ trong nhiều tháng. Một số nghiên cứu cũng cho thấy rằng CFSE có thể được sử dụng để theo dõi sự tăng sinh của tế bào lympho in vitro và cả in vivo thông qua phương pháp theo dõi cường độ phát quang của CFSE của các tế bào