- N u ADN l n t p s th y có v t tr ng kéo dài trên gel.
- N u không có ADN thì trên b ng không xu t hi n v ch tr ng Các ADN có ch t l ng t t c ti n hành khu ch i PCR
2.2.3.2. Phân tích PCR
ng 2.4: Chu n b dung d ch PCR cho m t ph n ng
Thành ph n Pha dung d ch Th tích (µl) ng sau cùng
H2O 12,5
PCR buffer 10X 2 1X
dNTP 1mM 2 100µM
i xuôi 5µM 1 0,25 µM
i ng c 5µM 1 0,25 µM
Taq polymeraz 5 unit/µl 0,5 2,5 unit/20µl
ADN 25 ng/µl 1 1,25 ng/µl
ng c ng 20 µl
- Ghi nhãn c n th n trên tube 200µl dùng cho PCR. - Pha dung d ch cho ph n ng PCR.
- Tr n u.
- Dùng pipet l y 19µl cho vào m i tube có ch a s n ADN. - Nh 1 gi t d u ph trên dung d ch.
- Ly tâm.
Tùy thu c vào các d u chu n liên k t v i gen kháng b nh o ôn là STS ho c SSR, m i lo i d u chu n có chu trình h at ng c a máy PCR khác nhau.
ng 2.5: Chu trình ph n ng PCR cho d u chu n STS
Giai n 1 Giai n 2 Giai n 3 S chu k
Ch ng
trình Nhi t Th i
gian Nhi t Th igian Nhi t Th igian
1 94 oC 5 phút 1
2 94 oC 1 phút 55oC-60 oC 1 phút 72 oC 2 phút 30
3 72 oC 5 phút 1
4 4 oC
ng 2.6: Chu trình ph n ng PCR cho d u chu n SSR
Giai n 1 Giai n 2 Giai n 3
Ch ng trình Nhi t Th i gian Nhi t Th i gian Nhi t Th i gian chu k 1 94 oC 5 phút 1 2 94 oC 1 phút 55 oC 1 phút 72 oC 2 phút 35 3 72 oC 5 phút 1 4 4 oC
- L y m u ra khi hoàn thành các chu k . - Tr nhi t 4oC.
- Chu n b gel agarose 3% ( i v i d u chu n SSR), agarose 1,5% ( i v i u chu n STS), g m agarose và TBE 1X.
- L y 8 - 10 µl s n ph m PCR c ng v i 2 - 4µl loading buffer cho vào m i gi ng .
- Ch y n di n m kho ng 2 - 3 gi . - Ch p hình gel.
- Phân tích hình gel: v trí các b ng v ch th hi n trên gel c k t lu n khi so t ng ng v i b ng chu n kháng ho c b ng chu n nhi m.
2.3.3. Lai ch ng gen t o qu n th ch ng nhi u gen kháng[8]
A x R1 A x R2 A x R3 A x R4 F1 x A F1 x A F1 x A F1 x A BC1R1F1 x BC1R2F1 BC1R3F1 x BC1R4F1 F1 x F1 F1 (t th ) F2
2.1: Lai ch ng gen t o qu n th ch ng nhi u gen kháng
- Gi ng A c dùng làm m (dòng tái t c) là gi ng lúa n nh, có nhi u c tính t t nh n ng su t cao, ph m ch t t t.
- Các gi ng R1, R2, R3, R4 c dùng cha là các gi ng có mang gen kháng (gen cho) v i nòi ph bi n BSCL.
- BC (backcross): lai ng c l i v i dòng tái t c.
- S d ng d u chu n phân t ch n l c cây mang gen kháng (qui t t ng gen kháng) n gen trên 4 qu n th BC1R1F1, BC1R2F1, BC1R3F1, BC1R4F1. Các cá th mang gen kháng s c s d ng ti p t c cho lai ch ng gen.
Qu n th th 1
- ánh giá ki u hình kháng, nhi m b nh o ôn qu n th con lai ch ng nhi u gen kháng F1, F2 (qui t 2 - 3 gen kháng) v i ch ng n m c ch n là c tính
BSCL.
- S d ng d u chu n phân t ch n l c con lai F2 (qui t 2 - 3 gen kháng) a qu n th th 2 ch ng nhi u gen kháng.
2.3.4. ánh giá m t s c tính nông h c, thành ph n n ng su t và n ng su ta các dòng lúa có tri n v ng ch ng gen kháng b nh o ôn a các dòng lúa có tri n v ng ch ng gen kháng b nh o ôn
Khi các dòng lúa mang nhi u gen kháng c ánh giá t thu n cao (>99%, t th h F6), ti n hành ánh giá c m nông h c, so sánh n ng su t và ch t l ng g o phát tri n thành gi ng s n xu t.