nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại Gấc trong điều kiện phòng thí
nghiệm
Mục tiêu thí nghiệm
Nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với chủng nấm
Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại gấc trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Gồm 2 thí nghiệm
− Thí nghiệm 1a: đánh giá nhanh khả năng đối kháng nhanh của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Colletotrichum spp. Trong điều kiện phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện với không lặp lại.
− Thí nghiệm 1b: đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đƣợc chọn lọc ở thí nghiệm 1a với nấm Colletotrichum spp. với 4 lần lặp lại. Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong đó mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức.
Phƣơng pháp thực hiện: thí nghiệm 1a và 1b đƣợc thực hiện với phƣơng pháp giống nhau.
Bƣớc 1: Nguồn nấm đƣợc cấy vào đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDA. Khi nấm đã phát triển đƣợc khoảng 7 ngày thì dùng dụng cụ đục lỗ đƣờng kính 5 mm đục lấy khoanh nấm từ đĩa nguồn chuyển vào giữa đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng ISP2.
Bƣớc 2: Đặt khoanh nấm Colletotrichum spp. có đƣờng kính 5 mm ở giữa đĩa, khoanh giấy thấm vô trùng tẩm huyền phù xạ khuẩn đƣợc đặt ở vị cách khoanh nấm 2,5 cm ở 2 điểm đối diện khoanh nấm (hình 2.1). Trên mỗi đĩa Petri đƣợc thử nghiệm với 2 chủng xạ khuẩn.
18
Bƣớc 4: Theo dõi và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm bằng cách đo bán kính vòng vô khuẩn và tính hiệu suất đối kháng vào thời điểm 3, 5, 7 NSKC.
Hình 2.1: Mô tả cách bố trí thí nghiệm thử đối kháng
Hiệu suất đối kháng (HSĐK):
HSĐ 100 ĐC XK ĐC BKKL BKKL BKKL K
HSĐK: Hiệu suất đối kháng (%).
BKKLĐC: Bán kính khuẩn lạc nằm về phía đối chứng (mm). BKKLXK: Bán kính khuẩn lạc nằm về phía xạ khuẩn (mm).
Xử lý số liệu và thống kê:
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
2.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh thán thƣ trên trái Gấc do nấm Colletotrichum spp. gây ra bằng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích
Nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn cũng nhƣ thời điểm xử lí cho hiệu quả phòng trị bệnh thán thƣ trên trái Gấc do nấm Colletotrichum spp. gây ra.
Cách tiến hành
Phƣơng pháp thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố, với 5 lần lập lại với ba thời điểm xử lí. Nhân tố (A): 2 chủng xạ khuẩn NCT_TG4, GCT_TG9. Nhân tố (B): thời điểm xử lí, bao gồm sử dụng xạ khuẩn trƣớc khi lây bệnh nhân tạo 2 ngày, sau khi lây bệnh nhân tạo 2 ngày và kết hợp trƣớc khi lây
19
bệnh nhân tạo 2 ngày, sau lây bệnh nhân tạo 2 ngày (trƣớc + sau). Nghiệm thức đối chứng: không xử lí.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm Colletotrichum spp. đƣợc cấy trên đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDA (cấy trƣớc 10-14 ngày) ở điều kiện 12 giờ sáng, 12 giờ tối xen kẽ, nhiệt độ 250C cho nấm tạo bào tử để làm thí nghiệm. Nấm sau khi nuôi cấy 10-14 ngày, ta tiến hành thu huyền phù bào tử nấm bằng cách cho nƣớc cất thanh trùng vào đĩa nấm, dùng cây cạo nấm cạo lên bề mặt khuẩn lạc nấm và thu huyền phù có chứa bào tử nấm, dùng lam đếm hồng cầu đếm mật số bào tử nấm chứa trong huyền phù, sau đó thực hiện pha loãng để đạt huyền phù nấm với mật số 106 bào tử/ml.
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MS 7 ngày. Cho nƣớc cất thanh trùng vào đĩa xạ khuẩn cạo khuẩn lạc và thu đƣợc huyền phù bào tử xạ khuẩn. xác định mật số huyền phù xạ khuẩn bằng phƣơng pháp pha loãng chà đĩa trong 48h. Tiến hành đếm mật số khuẩn lạc ở các nồng độ pha loãng quy ra mật số ban đầu. Thực hiện phƣơng pháp pha loãng để đật mật số huyền phù là 108 cfu/ml.
Cách xử lí xạ khuẩn: bơm 20 µl huyền phù xạ khuẩn ở mật số 108 cfu/ml vào vị trí tạo vết thƣơng ở các thời điểm tƣơng đƣơng với từng nghiệm thức.
Chuẩn bị trái Gấc: chọn trái Gấc sắp chín mua từ vƣờn về phải cùng giống, có kích cỡ 0,5-0,8 kg, cùng màu sắc. Sau đó tiến hành loại bỏ những trái bị sâu, bệnh không đạt yêu cầu.
Cách lây bệnh nhân tạo:
Trái Gấc đƣợc thanh trùng về bề mặt cồn 700 nhằm loại bỏ một số vi sinh vật có sẵn trên bề mặt trái Gấc.
Dùng bó kim 10 que đƣợc thanh trùng châm vào bề mặt trái gấc (10 điểm) để tạo vết thƣơng, sau đó bơm 20 µl huyền phù nấm Colletotrichum spp. (mật số 106 bào tử/ml) vào từng trái Gấc tại vị trí tạo vết thƣơng.
Ghi nhận chỉ tiêu: đo đƣờng kính vết bệnh tại các thời điểm 2, 4 và 6 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo.
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
2.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn có triển vọng
Mục đích
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lí bệnh thán thƣ hại Gấc thông qua cơ chế tiết ra enzyme cellolase.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 lần lặp lại. Mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức.
20 Tiến hành
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn đƣợc nuôi trong ống nghiệm chứa môi trƣờng MS trong 5 ngày.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng CMC 1%. Đặt khoanh giấy thấm vô trùng tẩm huyền phù xạ khuẩn có đƣờng kính 5 mm tại 3 vị trí cách đều nhau trên đĩa Petri đã đƣợc đánh dấu sẵn (hình 2.2).
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận chỉ tiêu: Đo bán kính phân giải cellulose (mm) ở thời điểm 3, 5, 7 NSKC.
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân giải cellulose trên mô i trƣờng CMC 1% trong đĩa Petri
Xử lí số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
Khoanh giấy thấm 5 mm có tẩm huyền phù xạ khuẩn Môi trƣờng CMC 1% Xạ khuẩn 1 Xạ khuẩn 2 Xạ khuẩn 3
21
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN