Nghiên cứu của Boojar và ctv. (2006) ghi nhận trong 200 chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập từ nhiều loại đất khác nhau của tỉnh Kerman trong đó chủng xạ khuẩn Streptomyces coralus có khả năng đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cho cây trồng sau 8-11 ngày sau khi nuôi cấy trong điều kiện in vitro.
Tan và ctv. (2006) đã phân lập chủng xạ khuẩn từ đất xung quanh vùng rễ của các cây cà chua mạnh khỏe và bị héo có khả năng đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Kết quả cho thấy Streptomyces chiếm phần lớn, tỉ lệ tế bào vi khuẩn gây bệnh bị phân hủy bởi Streptomyces ở cây héo nhiều hơn cây khỏe. Sự đa dạng của chủng xạ khuẩn Streptomyces cũng ảnh hƣởng tới khả năng kiểm soát mầm bệnh của chúng trên cây trồng.
Theo nghiên cứu của Ezziyyani và ctv. (2007) trong việc kết hợp
Trichoderma haiamum và Streptomyces rochei để kiểm soát bệnh thối rễ trên ớt do nấm Phytophthora capsici thì thấy đƣợc việc kết hợp này giúp ức chế đƣợc sợi nấm
P.capsici trên đĩa Petri sau 2 ngày. Đặc biệt, khi sử dụng hai loại này để xử lý đất thì sau 2 tháng xử lý mầm bệnh trong đất giảm 70%.
Năm 2005, Getha và ctv. nghiên cứu đƣợc Streptomyces sp. chủng G10 thể hiện sự đối kháng mạnh mẽ đối với Fusarium oxysporum f.sp. cubense (FOC) race 1, 2 và 4 trong thí nghiệm bằng cách sản xuất các chất chuyển hóa ngoại bào kháng nấm.
Theo Lu và ctv. (2008) phân lập đƣợc chủng xạ khuẩn A01 đƣợc xác định là
Streptomyces lydicus. Chủng A01 thể hiện phổ kháng khuẩn khá rộng với hoạt động ức chế ổn định và mạnh mẽ chống lại một số loại nấm gây bệnh cây trồng, nhƣ
Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Monilinia laxa, vv. Trong điều kiện nhà lƣới dịch trích từ chủng A01 thể hiện hiệu quả kiểm soát bệnh nấm mốc trên cà chua hơn so với những thuốc trừ nấm Pyrimethanil và Polyoxin. Qua quá trình phân tích cấu trúc hóa học với UV, IR, MS và NMR xác nhận rằng hợp chất đƣợc sản xuất bởi chủng A01 là natamycin, một kháng sinh polyene sản xuất bởi S. chattanovgensis, S. natalensis và S. gilvosporeus đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một chất bảo quản sinh học tự nhiên. Nghiên cứu này cho thấy một dòng sản xuất mới của natamycin và ứng dụng tiềm năng của nó nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học bệnh cây nấm.
Theo nghiên cứu gần đây của Prapagdee và ctv. (2008) phân lập và xác định chủng SRA14 là Streptomyces hygroscopicus có khả năng kháng lại Colletotrichum gloeosporioides và Sclerotium rolfsii gây ra bệnh thán thƣ và bệnh cháy lá , thối gốc trong nhiều loại cây trồng nông nghiệp. Chủng SRA14 thể hiện khả năng ức chế
14
nấm bằng cách tiết ra các emzyme ngoại bào nhƣ chitinase và β - 1, 3- glucanase, còn có khả năng làm biến dạng các sợi nấm.
Trong cuộc điều tra khảo sát hoạt động kháng nấm từ dịch trích của
Actinomyces của Sharma và Parihar (2010) đã đƣợc thực hiện phân lập actinomycetes từ đất, chiết xuất các hợp chất kháng nấm từ các actinomycetes bị cô lập và sau đó thử nghiệm chiết xuất chống lại sự tăng trƣởng của Alternaria sp,
Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium sp, và Rhizopus stolonifer. Kết quả tìm thấy rằng gần nhƣ tất cả các chất chiết xuất có hiệu quả chống lại các nấm gây hại và sự trƣởng của sợi nấm là tỉ lệ nghịch với nồng độ chiết xuất.
15
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 PHƢƠNG TIỆN
− Thời gian thực hiện: Đề tài thực hiện từ tháng 1/2013 đến tháng 11/2013. − Địa điểm: Các thí nghiệm đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
2.1.1. Trang thiết bị và vật liệu dùng trong thí nghiệm
Nguồn nấm gây bệnh: Nguồn nấm Colletotrichum spp. đƣợc cung cấp từ phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Nguồn xạ khuẩn: đƣợc phân lập từ những mẫu đất ở những vƣờn trồng gấc tại 3 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Tiền Giang .
Dụng cụ thí nghiệm trong phòng: bao gồm micropipette (Gilson, France), máy ảnh sony, đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, đũa cấy, đèn cồn, giấy thấm, cồn 700,…
Thiết bị thí nghiệm trong phòng: tủ cấy vi sinh, tủ sấy, nồi hấp, cân điện tử, máy lắc ngang,…
Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật:
+ Môi trƣờng WA (Water agar)
Agar 20g
Nƣớc cất 1000 ml
pH 7,0
+ Môi trƣờng PDA (Shurtleff và Averre III, 1997)
Khoai tây 200g
Dextrose 20g
Agar 20g
Nƣớc cất 1000 ml
pH 6,7
+ Môi trƣờng Manitol Soya Flour medium (MS) (Hobbs và ctv., 1989)
Bột đậu nành 20g
D-Manitol 20g
Agar 20g
Nƣớc cất 1000 ml
16
+ Môi trƣờng Chitin Agar cải tiến (Shurtleff và Averre, 1997)
Colloidal chitin 4g KH2PO4.3H2O 0,7g MgSO4.7H2O 0,5g KH2PO4 0,5g FeSO4.7H2O 0,01g ZnSO4.7H2O 0,001g Peptone 10g Agar 20g Nƣớc cất 1000 ml pH 7,0
+ Môi trƣờng ISP2 (International Streptomyces Project-2) (Holt và ctv., 1994)
Yeast extract 4g/l Glucose 4g/l Malt extract 10g/l Agar 18g/l Nƣớc cất 1000 ml pH 7,2 + Môi trƣờng CMC 1% (Võ Hoài Bắc và ctv., 2010) CMC 10g MgSO4 0,2g NaHCO3 0,2g K2HPO4 5g CaCl2 0,2g NaCl 0,2g Peptone 0,2g Nƣớc cât 1000 ml pH 7,2-7,4
Dung dich Lugol (Neergaard, 1997)
17
2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Phân lập xạ khuẩn 2.2.1. Phân lập xạ khuẩn
Mẫu đất đƣợc thu trên những vƣờn trồng Gấc, chọn đất ngay dƣới gốc Gấc, độ sâu thu mẫu đất từ 20 – 25cm.
Phƣơng pháp tiến hành
1) Cân 4 gam đất + 40 ml nƣớc cất thanh trùng cho vào ống Falcon. 2) Lắc trong 30 phút.
3) Pha loãng ở 4 nồng độ: 10-1 ,10-2, 10-3, 10-4.
4) Rút 50μl huyền phù ở nồng độ 10-3 và 10-4 cho vào đĩa Petri chứa môi trƣờng chitin, mỗi nồng độ chà trong 2 đĩa. Đĩa đƣợc ủ trong 2 - 3 ngày, sau đó tách ròng bằng cách dùng que cấy vi khuẩn đã khử trùng vít bào tử xạ khuẩn chà lên đĩa chứa môi trƣờng MS. Dùng đũa cấy vi khuẩn đã khử trùng vít một khuẩn lạc và cấy vào ống nghiệm chứa môi trƣờng MS đổ mặt nghiêng.
2.2.2. Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với
nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại Gấc trong điều kiện phòng thí
nghiệm
Mục tiêu thí nghiệm
Nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với chủng nấm
Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại gấc trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Gồm 2 thí nghiệm
− Thí nghiệm 1a: đánh giá nhanh khả năng đối kháng nhanh của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Colletotrichum spp. Trong điều kiện phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện với không lặp lại.
− Thí nghiệm 1b: đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đƣợc chọn lọc ở thí nghiệm 1a với nấm Colletotrichum spp. với 4 lần lặp lại. Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong đó mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức.
Phƣơng pháp thực hiện: thí nghiệm 1a và 1b đƣợc thực hiện với phƣơng pháp giống nhau.
Bƣớc 1: Nguồn nấm đƣợc cấy vào đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDA. Khi nấm đã phát triển đƣợc khoảng 7 ngày thì dùng dụng cụ đục lỗ đƣờng kính 5 mm đục lấy khoanh nấm từ đĩa nguồn chuyển vào giữa đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng ISP2.
Bƣớc 2: Đặt khoanh nấm Colletotrichum spp. có đƣờng kính 5 mm ở giữa đĩa, khoanh giấy thấm vô trùng tẩm huyền phù xạ khuẩn đƣợc đặt ở vị cách khoanh nấm 2,5 cm ở 2 điểm đối diện khoanh nấm (hình 2.1). Trên mỗi đĩa Petri đƣợc thử nghiệm với 2 chủng xạ khuẩn.
18
Bƣớc 4: Theo dõi và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm bằng cách đo bán kính vòng vô khuẩn và tính hiệu suất đối kháng vào thời điểm 3, 5, 7 NSKC.
Hình 2.1: Mô tả cách bố trí thí nghiệm thử đối kháng
Hiệu suất đối kháng (HSĐK):
HSĐ 100 ĐC XK ĐC BKKL BKKL BKKL K
HSĐK: Hiệu suất đối kháng (%).
BKKLĐC: Bán kính khuẩn lạc nằm về phía đối chứng (mm). BKKLXK: Bán kính khuẩn lạc nằm về phía xạ khuẩn (mm).
Xử lý số liệu và thống kê:
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
2.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh thán thƣ trên trái Gấc do nấm Colletotrichum spp. gây ra bằng xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích
Nhằm tìm ra chủng xạ khuẩn cũng nhƣ thời điểm xử lí cho hiệu quả phòng trị bệnh thán thƣ trên trái Gấc do nấm Colletotrichum spp. gây ra.
Cách tiến hành
Phƣơng pháp thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố, với 5 lần lập lại với ba thời điểm xử lí. Nhân tố (A): 2 chủng xạ khuẩn NCT_TG4, GCT_TG9. Nhân tố (B): thời điểm xử lí, bao gồm sử dụng xạ khuẩn trƣớc khi lây bệnh nhân tạo 2 ngày, sau khi lây bệnh nhân tạo 2 ngày và kết hợp trƣớc khi lây
19
bệnh nhân tạo 2 ngày, sau lây bệnh nhân tạo 2 ngày (trƣớc + sau). Nghiệm thức đối chứng: không xử lí.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm Colletotrichum spp. đƣợc cấy trên đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDA (cấy trƣớc 10-14 ngày) ở điều kiện 12 giờ sáng, 12 giờ tối xen kẽ, nhiệt độ 250C cho nấm tạo bào tử để làm thí nghiệm. Nấm sau khi nuôi cấy 10-14 ngày, ta tiến hành thu huyền phù bào tử nấm bằng cách cho nƣớc cất thanh trùng vào đĩa nấm, dùng cây cạo nấm cạo lên bề mặt khuẩn lạc nấm và thu huyền phù có chứa bào tử nấm, dùng lam đếm hồng cầu đếm mật số bào tử nấm chứa trong huyền phù, sau đó thực hiện pha loãng để đạt huyền phù nấm với mật số 106 bào tử/ml.
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MS 7 ngày. Cho nƣớc cất thanh trùng vào đĩa xạ khuẩn cạo khuẩn lạc và thu đƣợc huyền phù bào tử xạ khuẩn. xác định mật số huyền phù xạ khuẩn bằng phƣơng pháp pha loãng chà đĩa trong 48h. Tiến hành đếm mật số khuẩn lạc ở các nồng độ pha loãng quy ra mật số ban đầu. Thực hiện phƣơng pháp pha loãng để đật mật số huyền phù là 108 cfu/ml.
Cách xử lí xạ khuẩn: bơm 20 µl huyền phù xạ khuẩn ở mật số 108 cfu/ml vào vị trí tạo vết thƣơng ở các thời điểm tƣơng đƣơng với từng nghiệm thức.
Chuẩn bị trái Gấc: chọn trái Gấc sắp chín mua từ vƣờn về phải cùng giống, có kích cỡ 0,5-0,8 kg, cùng màu sắc. Sau đó tiến hành loại bỏ những trái bị sâu, bệnh không đạt yêu cầu.
Cách lây bệnh nhân tạo:
Trái Gấc đƣợc thanh trùng về bề mặt cồn 700 nhằm loại bỏ một số vi sinh vật có sẵn trên bề mặt trái Gấc.
Dùng bó kim 10 que đƣợc thanh trùng châm vào bề mặt trái gấc (10 điểm) để tạo vết thƣơng, sau đó bơm 20 µl huyền phù nấm Colletotrichum spp. (mật số 106 bào tử/ml) vào từng trái Gấc tại vị trí tạo vết thƣơng.
Ghi nhận chỉ tiêu: đo đƣờng kính vết bệnh tại các thời điểm 2, 4 và 6 ngày sau khi lây bệnh nhân tạo.
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
2.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn có triển vọng
Mục đích
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lí bệnh thán thƣ hại Gấc thông qua cơ chế tiết ra enzyme cellolase.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 lần lặp lại. Mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức.
20 Tiến hành
Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: xạ khuẩn đƣợc nuôi trong ống nghiệm chứa môi trƣờng MS trong 5 ngày.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng CMC 1%. Đặt khoanh giấy thấm vô trùng tẩm huyền phù xạ khuẩn có đƣờng kính 5 mm tại 3 vị trí cách đều nhau trên đĩa Petri đã đƣợc đánh dấu sẵn (hình 2.2).
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận chỉ tiêu: Đo bán kính phân giải cellulose (mm) ở thời điểm 3, 5, 7 NSKC.
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân giải cellulose trên mô i trƣờng CMC 1% trong đĩa Petri
Xử lí số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý với phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
Khoanh giấy thấm 5 mm có tẩm huyền phù xạ khuẩn Môi trƣờng CMC 1% Xạ khuẩn 1 Xạ khuẩn 2 Xạ khuẩn 3
21
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của những chủng xạ khuẩn đối với nấm Colletotrichum spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm với nấm Colletotrichum spp. trong điều kiện phòng thí nghiệm
3.1.1 Phân lập xạ khuẩn trên vƣờn trồng Gấc tại 3 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Tiền Giang Tiền Giang
Từ những mẫu đất thu thập đƣợc trên vƣờn Gấc và đƣợc phân lập trên môi trƣờng chọn lọc xạ khuẩn (chitin agar), kết quả thu đƣợc 120 chủng xạ khuẩn (Bảng 3.1).
Bảng 3.1 Các nguồn xạ khuẩn thu thập đƣợc từ An Giang, Tiền Giang và Cần Thơ STT Chủng xạ khuẩn Địa điểm phân lập
1 TLTT_AG1 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
2 TLTT_AG2 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
3 TLTT_AG3 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
4 TLTT_AG4 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
5 TLTT_AG5 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
6 TLTT_AG6 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
7 TLTT_AG7 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
8 TLTT_AG8 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
9 TLTT_AG9 Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang
10 ATT_AG1 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
11 ATT_AG2 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
12 ATT_AG3 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
13 ATT_AG4 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
14 ATT_AG5 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
15 ATT_AG6 An Cƣ – Tri Tôn – An Giang
16 BT_CT1 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
17 BT_CT2 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
18 BT_CT3 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
19 BT_CT4 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
20 BT_CT5 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
21 BT_CT6 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
22 BT_CT7 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
23 BT_CT8 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
24 BT_CT9 Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ
25 OM_CT1 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
26 OM_CT2 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
27 OM_CT3 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
28 OM_CT4 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
29 OM_CT5 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
30 OM_CT6 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
22
Bảng 3.1 Các nguồn xạ khuẩn thu thập đƣợc từ An Giang, Tiền Giang và Cần Thơ (tt)
32 OM_CT8 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
33 OM_CT9 Long Hƣng - Ô Môn – Cần Thơ
34 CG_TG1 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 35 CG_TG2 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 36 CG_TG3 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 37 CG_TG4 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 38 CG_TG5 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 39 CG_TG6 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 40 CG_TG7 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 41 CG_TG8 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 42 CG_TG9 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 43 CG_TG10 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 44 CG_TG11 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 45 CG_TG12 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 46 CG_TG13 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 47 CG_TG14 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 48 CG_TG15 Long Bình Điền – Chợ Gạo – Tiền Giang R2 49 GCT_TG1 Thạnh Nhựt – Gò Công Tây – Tiền Giang