1. Thời gian:
-Từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 5 năm 2009.
2. Địa điểm:
-Phòng Công Nghệ gen thực vật-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 1. Vô trùng mẫu cấy:
Mẫu cấy vô trùng sẽ đảm bảo cho thí nghiệm đạt kết quả tốt vì thế giai đoạn vô trùng hạt gạo trước khi cấy rất quan trọng. Hạt gạo sẽ được khử trùng theo phương pháp như sau:
-Bước 1: Tách vỏ trấu khỏi hạt gạo.
-Bước 2: Chọn những hạt gạo có phôi trắng (200 hạt). -Bước 3: Cho hạt gạo vào bình tam giác đã vô trùng.
-Bước 4: Cho cồn 700 vào bình tam giác chứa gạo và khuấy đều bằng máy khuấy
từ trong 1 phút.
-Bước 5: Đổ bỏ cồn, cho nước Javen vào bình tam giác cho đến khi ngập gạo, cho thêm 1-2 giọt Tween 20, khuấy đều trên máy khuấy từ trong 25 phút.
-Bước 6: Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến khi sạch bã lợn cợn -Bước 7: Làm khô hạt gạo trên dĩa Petri có lót giấy thấm đã khử trùng. Các bước từ 3 đến 7 được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của mô sẹoa) Tiến hành thí nghiệm: a) Tiến hành thí nghiệm:
Hạt gạo đã khử trùng sẽ được cấy trên các môi trường CIM (Xem phụ lục) trong tủ cấy vô trùng. Ở mỗi nhiệt độ, sử dụng 200 hạt cho mỗi giống. Mỗi đĩa Petri cấy 20 hạt. Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 10 lần lặp lại. Các dĩa Petri sau khi đã cấy hạt gạo vào sẽ được quấn bằng giấy paraffin. Đem ủ ở hai nhiệt
độ 28±10
C và 32±10C trong điều kiện tối hoàn toàn.
b) Ghi nhận kết quả
Quan sát sự tạo thành mô sẹo của hạt gạo ở các nhiệt độ. Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ mô sẹo có chất lượng tốt (mô có các cấu trúc hình cầu, chặt và khô) ở mỗi nhiệt độ sau 3 tuần.
3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng lên sự phát triển của mô sẹo của mô sẹo
a) Tiến hành thí nghiệm:
Các hạt gạo đã khử trùng sẽ được cấy trên môi trường CIM (Xem phụ lục) trong tủ cấy. Trong từng điều kiện chiếu sáng, sử dụng 200 hạt lúa của mỗi giống cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa Petri cấy 20 hạt. Ở mỗi điều kiện chiếu sáng có 10 lần lặp lại với cách bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Quấn kín bằng giấy paraffin trong tủ cấy vô trùng. Sau đó đem ủ ở điều kiện chiếu sáng liên tục và trong điều kiện tối hoàn toàn. Nhiệt độ nuôi cấy trong thí nghiệm này là kết quả của thí nghiệm 1.
b) Ghi nhận kết quả
Quan sát sự tạo mô sẹo ở các điều kiện ánh sáng khác nhau. Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở mỗi điều kiện ánh sáng sau 3 tuần.
4. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose lên sự phát triển của mô sẹo sẹo
a) Tiến hành thí nghiệm:
Các hạt gạo đã khử trùng sẽ được cấy trên các môi trường CIM và CIM 3% Maltose (Xem phụ lục) trong điều kiện vô trùng. Ở mỗi môi trường, sử dụng 200 hạt gạo của mỗi giống cấy trên đĩa Petri. Mỗi đĩa cấy 20 hạt, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố với 10 lần lặp lại ở mỗi môi trường. Các dĩa Petri sau khi cấy các hạt gạo sẽ được quấn kín bằng giấy paraffin và đem ủ ở điều kiện nhiệt độ và ánh sáng theo kết quả của thí nghiệm 1 và 2.
b) Ghi nhận kết quả
Quan sát sự tạo mô sẹo ở các môi trường khác nhau. Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở mỗi môi trường sau 3 tuần.
5. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các môi trường cấy chuyền đến khả năng tái sinh tái sinh
a) Tiến hành thí nghiệm:
Các mô sẹo 3 tuần tuổi từ môi trường nuôi cấy theo kết quả của thí nghiệm 3 và điều kiện nuôi cấy từ thí nghiệm 1 và 2 được chuyển sang môi trường mới để tăng thêm sinh khối và biệt hóa tốt hơn. Thí nghiệm được tiến
hành trên hai môi trường để xác định môi trường thích hợp, đáp ứng tốt cho quá trình tái sinh chồi.
Các môi trường bao gồm: CIM 3% Maltose, CIM-J3 (Xem phụ lục). Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố với 4 lần lặp lại.
b) Ghi nhận kết quả
Quan sát sự phát triển của mô sẹo ở các môi trường. Ghi nhận tỷ lệ mô sẹo có chất lượng tốt và sự tiết phenol ở các nghiệm thức khác nhau.
6. Tạo chồi và tạo rễ
Không phải tất cả các mô sẹo đều có khả năng tái sinh. Chỉ những mô sẹo có cấu trúc hình cầu chặt và khô mới tạo được chồi trong môi trường thích hợp. Môi trường tạo chồi sử dụng ở đây dựa trên môi trường SIM-B1 của Huỳnh Thị Hồng Mai (2005) (Xem phụ lục).
Những chồi tái sinh cao khoảng 2cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ (Xem phụ lục) trong bình tam giác 250ml, đậy bằng nút gòn. Các bình tam giác được để ở nhiệt độ 280
C với điều kiện chiếu sáng là 16h sáng và 8h tối.
7. Xử lý số liệu
Các số liệu được tính toán và vẽ biểu đồ bằng chương trình Microsoft Excel. Quá trình phân tích thống kê được tiến hành trên phần mềm MSTATC với phương pháp phân tích T-TEST, ANOVA và so sánh LSD 5%.
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của mô sẹo
Kết quả ở hình 2 cho thấy giống IR64 có sự khác biệt rõ về khả năng
hình thành mô sẹo ở hai nhiệt độ. Tại nhiệt độ 280C tỷ lệ hình thành mô sẹo là
60.5% trong khi ở nhiệt độ 320C là 49%. Bên cạnh đó, tỷ lệ mô có chất lượng tốt
(mô khô, có nhiều cấu trúc hình cầu) (Hình 1) ở nhiệt độ 320C (41.50%) cao hơn
so với nhiệt độ 280C (39.5%). Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về
mặt thống kê.
Đối với giống MTL250 (Hình 3), tỷ lệ hình thành mô sẹo ở nhiệt độ 280
C
và 320C cao tương ứng với 95% và 96%. Tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở nhiệt độ
320C (40.50%) cao hơn ở 280C (37%) nhưng sự khác biệt này không đáng kể.
Hình 1: Cấu trúc hình cầu
Năm 2006, Abayawickrama và Anai đã báo cáo về ảnh hưởng của nhiệt
độ lên khả năng hình thành mô sẹo ở một số giống lúa thuộc dòng indica. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 300C sự hình thành mô sẹo tốt hơn so với nhiệt độ 250C. Trong các nghiên cứu của nhiều tác giả, nhiệt độ nuôi cấy mô lúa thay đổi từ 250C đến 320
C.
Sự khác biệt này có thể do các giống lúa ở mỗi nơi có đặc tính khác nhau nên điều kiện nuôi cấy cũng khác nhau.
Kết quả thí nghiệm cho thấy nhiệt độ 280C hay 320C đều không có ảnh hưởng
đáng kể lên sự hình thành mô sẹo và chất lượng của mô ở giống MTL250. Giống IR64 cũng không bị ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hình thành chất lượng của mô
nhưng tỷ lệ hình thành mô sẹo ở nhiệt độ 280
C có sự khác biệt đáng kể so với
nhiệt độ 320C. So với giống IR64 thì tỷ lệ mô sẹo của MTL250 cao hơn nhưng
Hình 2: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống IR64
Hình 3: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250
Chất lượng của mô là một trong những yếu tố quyết định khả năng tái sinh của mô sẹo. Cả hai giống lúa MTL250 và IR64 đều có tỷ lệ hình thành mô đạt chất lượng tốt ở 320C cao hơn ở 280
C. Mặc dù sự khác biệt này không có ý
nghĩa về mặt thống kê nhưng điều kiện nhiệt độ 280
C có thể gây ra một vài bất
lợi trong những nghiên cứu xa hơn về khả năng chuyển gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens. Do đó, điều kiện nhiệt độ 320
C đã được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
II. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng lên sự phát triển của mô sẹo triển của mô sẹo
Dựa trên kết quả của thí nghiệm 1, thí nghiệm 2 được tiến hành ở nhiệt độ
320C với hai điều kiện ánh sáng: chiếu sáng liên tục và để trong tối hoàn toàn.
Theo biều đồ (Hình 4), giống IR64 có tỷ lệ hình thành mô sẹo ở điều kiện tối (81.90%) cao hơn khi có ánh sáng (72.44%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa. Trong khi đó có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở hai điều kiện ánh sáng với tỷ lệ 70.47% ở trong tối và 51.36% khi có ánh sáng.
Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống IR64
Đối với giống MTL250, tỷ lệ hình thành mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở điều kiện chiếu sáng (91% và 80%) cao hơn ở điều kiện tối hoàn toàn (90.05% và 73.50%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250
Trong thí nghiệm về ảnh hưởng của ánh sáng lên sự hình thành mô sẹo ở giống RD6, Pipatpanukul và cộng sự (2004) đã kết luận rằng điều kiện chiếu sáng sẽ có hiệu quả tốt hơn trong sự hình thành của mô so với điều kiện không có ánh sáng. Năm 2005, Maneewan và cộng sự đã kết luận rằng khả năng hình thành mô sẹo cao hơn và kích thước trung bình của mô sẹo dưới điều kiện chiếu sáng sẽ cao hơn và lớn hơn so với điều kiện tối hoàn toàn khi nghiên cứu về giống lúa Chinat1. Cũng khảo sát về sự ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng lên một số giống lúa thuộc dòng indica, Abayawickrama và Anai (2006) đã cho thấy không có sự khác biệt giữa điều kiện sáng và tối lên khả năng tạo mô sẹo ở các giống lúa, chỉ có giống Ladywright có tỷ lệ mô sẹo trong điều kiện sáng cao hơn điều kiện tối.
Qua thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt giữa các điều kiện ánh sáng lên khả năng hình thành mô sẹo ở cả hai giống lúa. Đối với giống MTL250 cũng không có sự khác biệt đáng kể về khả năng tạo mô có chất lượng tốt nhưng giống IR64 thì tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở điều kiện tối khác biệt có ý nghĩa so với điều kiện có ánh sáng.
III. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose lên sự phát triển của mô sẹo
Kết quả phân tích (bảng 1) cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai loại môi trường tạo mô sẹo. Cả hai giống lúa đều có tỷ lệ mô sẹo và mô có chất lượng tốt cao hơn ở môi trường tạo mô sẹo có kết hợp với đường maltose. Trong khi đó, các điều kiện ánh sáng không còn ảnh hưởng đáng kể lên sự hình thành mô và chất lượng ở môi trường CIM3% maltose. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy giống MTL250 có khả năng hình thành mô sẹo và mô có chất lượng cao hơn giống IR64 trên môi trường CIM3% maltose.
Bảng 1: Tỷ lệ mô sẹo và mô có chất lượng tốt của hai giống IR64 và MTL250 ở các điều kiện môi trường và ánh sáng
IR64 MTL250
Môi trường Tỷ lệ mô sẹo chất lượng tốt Tỷ lệ mô có Tỷ lệ mô sẹo chất lượng tốt Tỷ lệ mô có
CIM sáng 43.50c 31.50c 70.50b 51.50b
CIM tối 54.50b 46.00b 66.00b 45.00b
CIM3% sáng 72.00a 59.00a 85.50a 70.00a
CIM3% tối 71.50a 58.50a 80.00a 66.50a
Trên cùng một cột các giá trị trung bình được theo sau cùng một chữ thì khác biệt không có ý nghĩa 5%.
Kết quả trên cũng tương tự như kết luận của Lin và Qifa Zhang (2005) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của các môi trường khác nhau lên hiệu quả chuyển gen trên các giống lúa thuộc dòng indica đã cho thấy rằng sử dụng đường maltose trong các môi trường có hiệu quả cao hơn so với đường sucrose. Tương tự, Zaidi và cộng sự (2006) đã báo cáo về ảnh hưởng của các loại đường lên khả năng hình thành mô sẹo, sự hình thành cấu trúc hình cầu và khả năng tạo chồi ở giống MDU5. Kết quả cho thấy ở môi trường sử dụng đường maltose có tỷ lệ tạo mô sẹo, tạo cấu trúc hình cầu và khả năng tạo chồi cao hơn so với môi trường sử dụng đường glucose và sucrose.
Qua thí nghiệm cho thấy môi trường tạo sẹo sử dụng kết hợp đường maltose có ảnh hưởng tốt hơn so với đường sucrose lên sự hình thành mô sẹo và chất lượng mô ở cả hai điều kiện sáng và tối.
IV. Thí Nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường cấy chuyền đến khả năng tái sinh của mô sẹo năng tái sinh của mô sẹo
Cấy chuyền là tiến trình chuyển vật liệu cấy mô đã được phân chia lần đầu sang môi trường mới giống hoặc khác với môi trường nuôi cấy ban đầu nhằm mục đích để cho mô đang phát triển được cung cấp thêm dinh dưỡng để tăng thêm sinh khối và biệt hóa tốt hơn. Chính vì vậy môi trường cấy chuyền cũng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh. Trong thí nghiệm này, các mô sẹo được nuôi trên môi trường CIM3% maltose sau 3 tuần được chuyển sang hai môi trường là môi trường CIM3% maltose ban đầu và môi trường CIM-J3 (Xem phụ lục) ở hai điều kiện sáng và tối. Theo bảng phân tích (bảng 2), môi trường CIM-J3 trong điều kiện tối có tỷ lệ mô đạt chất lượng tốt cao hơn môi trường CIM3% maltose. Ở giống IR64 tỷ lệ mô tốt ở môi trường CIM-J3 trong điều kiện tối có tỷ lệ cao nhất (48.21%) nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa đối với môi trường CIM3% maltose ở cùng điều kiện. Trong khi đó, ở điều kiện có ánh sáng thì tỷ lệ mô tốt trên môi trường CIM-J3 (30.36%) thấp hơn ở môi trường CIM3% maltose trong cả hai điều kiện ánh sáng. Điều này cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng lên quá trình phát triển của mô ở giai đoạn này. Giống MTL250 cũng có kết quả tương tự như giống IR64, mặc dù ở các thí nghiệm trước cho thấy điều kiện ánh sáng có ảnh hưởng tốt hơn lên sự phát triển của mô ở MTL250 nhưng ở giai đoạn cấy chuyền kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường CIM-J3 ở điều kiện tối có tỷ lệ mô tốt (34.38%) cao hơn ở các môi trường và điều kiện ánh sáng khác. Tỷ lệ mô tốt trong điều kiện chiếu sáng ở môi trường CIM-J3 cũng thấp hơn các điều kiện còn lại. Bên cạnh đó, trong điều kiện có ánh sáng thì có hiện tượng tiết phenol của mô lúa trên môi trường CIM- J3 (hình 6). Hiện tượng này có thể do ánh sáng cùng với các thành phần trong môi trường CIM-J3 đã kích thích mô tiết phenol.
Bảng 2: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường cấy chuyền
IR64 MTL250
Môi trường Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Tỷ lệ mô có chất lượng tốt
CIM-J3 sáng 30.36b 21.88b
CIM-J3 tối 48.21a 34.38a
CIM3% sáng 30.95b 25.00b
CIM3% tối 41.67ab 28.13ab
Trên cùng một cột các giá trị trung bình được theo sau cùng một chữ thì khác biệt không có ý nghĩa 5%.
Hình 6: Hiện tượng tiết phenol ở môi trường CIM-J3 trong điều kiện có ánh sáng
Qua thí nghiệm cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng trong giai đoạn cấy chuyền và môi trường CIM-J3 trong điều kiện tối hoàn toàn có tỷ lệ mô đạt chất lượng cao nhất ở cả hai giống lúa. Kết quả trên cũng tương tự như báo cáo của Lin và Qifa Zhang (2005) đã kết luận rằng môi trường CIM-J3 là môi trường thích hợp nhất cho giai đoạn cấy chuyền cho các dòng lúa indica.
V. Tạo chồi và tạo rễ
Các mô đạt chất lượng ở thí nghiệm 4 (hình 7) được chuyển sang môi trường tạo chồi và tạo rễ. Kết quả cho thấy các mô có khả năng tạo chồi và tạo rễ (hình 8 và hình 9).
Hình 7: Mô có chất lượng tốt ở giai đoạn cấy chuyền
Hình 8: Mô sẹo tạo chồi
Hình 9: Tạo rễ
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. KẾT LUẬN
- Nhiệt độ 320C thích hợp cho quá trình hình thành mô sẹo và chất lượng