Mặc dù các mô sẹo ựã qua thanh lọc khi chuyển sang môi trường tạo chồi ựã ựược khuyến cáo không nên sử dụng mannose trong môi trường tạo chồi ựể chọn lọc. Tuy nhiên các cây tái sinh vẫn ựược tiếp tục nhận diện là cây ựã chuyển gen hay không dựa vào phương pháp phân tắch Chlorophenol-Red (CPR), phương pháp này ựược ựánh giá là có hiệu quả cao trong việc nhận biết cây chuyển gen (Lucca và ctv, 2001; Wright và ctv, 2001). Sau khi ựược tái sinh trên môi trường RO8 và trước khi cây con ựược ựem ra trồng trong nhà kắnh, rễ của cây tái sinh ựược phân tắch bằng phương pháp khảo sát (CPR). Trong dung dịch chứa chất chỉ thị CPR, nếu pH của dung dịch là 6.0 hoặc lớn hơn thì dung dịch có màu ựỏ ựậm. Nhưng khi dung dịch thử nghiệm bị acid hóa do hoạt ựộng chuyển hóa mannose của các tế bào sống, sẽ làm cho môi trường có màu vàng. Kết quả khảo sát (Hình 4.9) cho thấy rễ của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo ựã phát triển tốt trên môi trường chọn lọc RO5 ựều ựổi sang màu vàng, giống như sự biến ựổi màu ở mẫu ựối chứng dương (rễ cây chuyển gen PMI mẫu). Ngược lại, các rễ của cây không ựược chuyển gen sẽ không xảy ra hiện tượng acid hóa, cho nên màu của dung dịch không ựổi.
Hình 4.7: Kết quả thử nghiệm Chlorophenol-red (CPR) của cây chuyển gen (A1-B12), ựối chứng dương (C1-C2) và ựối chứng âm (C3-C4).
55
Thử nghiệm CPR ựược xem là một phương pháp ựơn giản và nhanh chóng ựể kiểm tra sự biểu hiện của gen pmi cây chuyển gen. Ở các nghiên cứu khác về chuyển gen sử dụng gen chọn lọc là pmi, phương pháp thử nghiệm CPR cũng thường ựược sử dụng phổ biến. Paola và ctv (2000)cũng áp dụng phương pháp kiểm tra này nghiên cứu chuyển gen trên lúa Taipei 309 sử dụng mannose là nhân tố chọn lọc, sử dụng vật liệu là rễ, kết luận rằng rễ sau một giờ tiền xử lý với mannose trước khi ủ 4 ngày với dung dịch thử nghiệm, ựã cho thấy ựây là bộ phận hiệu quả hơn trong việc dùng làm vật liệu cho phân tắch CPR ở cây lúa. Lá còn ựược sử dụng ựể làm vật liệu kiểm tra trong chuyển gen chọn lọc bằng pmi ở các cây khác như lúa mì và bắp (Wright và ctv, 2001). Ngoài ra, vật liệu dùng ựể thử nghiệm không chỉ có rễ mà còn sử dụng bộ phận lá non. Zhensheng và ctv (2005) cũng ứng dụng phương pháp này trên chuyển gen ở lúa miến, vật liệu là lá lúa non ựược cắt thành các mảnh có ựộ dài khoảng 0,5cm, và ủ trên môi trường thử nghiệm trong ựiều kiện tối từ 2 ựến 3 ngày, các lá này ựược lấy từ các cây chuyển gen ựược tái sinh trên môi trường vô trùng. Boscariol và ctv (2003) khi chuyển gen trên cam cũng sử dụng lá có trọng lượng khoảng 300mg ựể thử nghiệm, nhưng thời gian ủ từ 4 ựến 5 ngày, cũng cho thấy phương pháp này ựạt hiệu quả cao. Nghiên cứu chuyển gen trên mắa ựường của Mukesk và ctv (2006) cũng sử dụng vật liệu là các mẫu lá non vẫn còn cuốn lại ở ựọt của cây mắa tái sinh, và ở trọng lượng khoảng 500mg ựể kiểm tra. Ngoài ra dùng lá ựể kiểm tra còn ựược ứng dụng các nghiên cứu khác như trên táo (Juliana và ctv, 2006).
56
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ *****+☺☺☺☺+*****